Acetylgalactosaminidase

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α-N-Acetylgalactosidase (α-NAGAL, EC 3.2.1.49) ist eine lysosomale Exoglycosidase, die terminale α-N-acetylgalactosamin-Reste von Glycopeptiden und Glykolipiden spalten kann. Bei Menschen kann eine unzureichende α-NAGAL-Aktivität lysosomale Speicherkrankheiten wie die Schindler- und Kanzaki-Krankheit verursachen. Die lysosomale Speicherkrankheit wurde erstmals 1987 identifiziert, was zur Ansammlung von Substraten in den Geweben führte, die letztendlich zur Entwicklung klinischer Symptome führte. Bei der Schindler-Krankheit kann der Verlust der funktionellen α-NAGAL-Enzymaktivität zur Ansammlung von Glykolipiden und Glycopeptiden führen, was letztendlich zu neurologischen Erkrankungen und anderen Krankheiten führt. Der Phänotyp der Schindler-Krankheit wurde in drei Klassen unterteilt. Die Typ-I-Krankheit ist eine schwere infantile neurodegenerative Erkrankung. Bei der Typ-II-Krankheit (auch bekannt als Kanzaki-Krankheit) kann der Krankheitsbeginn im Erwachsenenalter zu leichten kognitiven Beeinträchtigungen und charakteristischen Hautläsionen, Angiokeratomen, führen. Die Typ-III-Krankheit zeigt ein Spektrum von Symptomen, einschließlich Anfällen, Kardiomyopathie und Autismus. Derzeit gibt es keine Behandlung für diese Krankheiten.

Die Struktur des menschlichen α-NAGAL offenbart die molekulare Basis der Schindler-Krankheit. Die Ansammlung von Bindungsstellen für kleine Moleküle um die aktive Stelle bietet die Möglichkeit, Moleküle zu entwerfen, die die Ligandenbindungsmerkmale nutzen können, die in der Struktur des menschlichen α-NAGAL offenbart werden. Diese Moleküle können als Inhibitoren oder chemische Chaperone des menschlichen α-NAGAL verwendet werden.

Abb. 1. A. Die von α-NAGAL katalysierte Reaktion (Clark, N.E.; Garman, S.C. 2009)

Die Beziehung zwischen α-NAGAL und α-GAL

Im menschlichen Genom ist das NAGA Gen eng mit dem α-Galactosidase A (GLA) Gen verwandt, und sie stammen von demselben evolutionären Vorläufer ab. Die entsprechenden Proteine, α-NAGAL und α-GAL, haben eine Identität der Aminosäuresequenz von 46%, aber die Substratspezifität ist unterschiedlich. Tatsächlich wurde α-NAGAL ursprünglich als α-GALB bezeichnet, da es als Isozym von α-GAL betrachtet wird. Neben der Entfernung der terminalen α-GalNAc-Zucker hat das menschliche α-NAGAL-Protein auch eine gewisse Reaktivität gegenüber Substraten mit terminalen α-Galactose-Zuckern.  

α-NAGAL und α-GAL-Proteine haben auch die Fähigkeit, die Hauptblutgruppenantigene zu konvertieren. Das α-NAGAL-Protein kann enzymatisch das Blutgruppen-A-Antigen in das Blutgruppen-O-Antigen umwandeln, und das α-GAL-Protein kann das Blutgruppen-B-Antigen in das Blutgruppen-O-Antigen umwandeln. Da Blutgruppe O ein universeller Spenderbluttyp ist, wurden die Enzyme α-NAGAL und α-GAL verwendet, um die Blutgruppen A, B und AB in Blutgruppe O umzuwandeln. Wenn das α-NAGAL- oder α-GAL-Protein defekt ist, werden die A- oder B-Blutgruppenantigene abnormal verarbeitet. Ein weiterer interessanter Aspekt von α-GAL und α-NAGAL bezieht sich auf die überlappende Spezifität von α-NAGAL, das Substrate mit terminalen α-GalNAc-Zuckern und terminalen α-Galactose-Gruppen (weniger effizient) erkennen und hydrolysieren kann. Allerdings kann der Mangel an α-GAL-Aktivität bei der Fabry-Krankheit nicht durch α-NAGAL kompensiert werden.

Gesamtbeschreibung der Struktur

Menschliches α-NAGAL ist ein Homodimer, wobei jedes Monomer 394 Reste enthält (ohne die 17-Rest-Signalsequenz) und in zwei Domänen unterteilt ist. Domäne 1 bildet ein (β/α)₈-Fass und Domäne 2 enthält acht antiparallele β-Stränge in zwei β-Blättern. Wie andere Mitglieder der Familie 27 und des Clans D der Glycosid-Hydrolasen befindet sich die aktive Stelle am C-Terminus der β-Kette in der ersten Domäne. Die aktive Stelle wird durch Schleifen gebildet, die C-terminal zu sechs aufeinanderfolgenden β-Strängen, den Strängen β1-β6, liegen. Die Reste, die die aktive Stelle bilden, sind zwischen menschlichem und Hühner-α-NAGAL streng konserviert, was darauf hinweist, dass diese Reste einen starken evolutionären Druck haben.

Das menschliche α-NAGAL-Protein ist negativ geladen mit einem isoelektrischen Punkt von 4,85, und die Oberfläche der Struktur zeigt eine offensichtliche negative Ladung. Da dieses Molekül normalerweise im niedrigen pH-Bereich des Lysosoms funktioniert, ist die Gesamtladung des Moleküls bei lysosomalem pH ungefähr neutral. Enzymatische Studien haben gezeigt, dass das Enzym bei pH 4,6 am effektivsten ist. Dieses Molekül ist ein hochglykosyliertes und disulfidreiches Glykoprotein. Das Wildtyp-Protein enthält fünf N-verknüpfte Glykosylierungsstellen (N124, N177, N201, N359, N385), vier Disulfidbindungen (C38-C80, C42-C49, C127-C158, C187-C209) und eine freie Cystein (C343).

Aufgrund seiner 46% Sequenzidentität überlagern sich menschliches α-NAGAL und menschliches α-GAL sehr gut. Die strukturbasierte Sequenzanpassung zeigte, dass selbst im zweiten Domäne, wo die Sequenzidentität auf 23% fiel, die Sekundärstruktur der beiden Proteine sehr konserviert war.

Abb. 2. Kristallstruktur des menschlichen α-N-Acetylgalactosaminidase (Clark, N.E.; Garman, S.C. 2009)