Enzymreinigung

Verschiedene Enzymreinigungsdienste sind bei Creative Enzymes verfügbar. Wir bieten Reinigung und Qualitätsanalyse in kleinen Versuchsmaßstäben oder großen industriellen Maßstäben aus natürlichen Ressourcen oder Produktionsmischungen für klinische, therapeutische, Forschungs- und chemische Industrien an. Unsere Dienstleistungen umfassen auch die vorläufigen Schritte sowie die Nachreinigung und Analyse.

Obwohl die ersten Charakterisierungen eines Enzyms in einer Mischung oder Probenmatrix praktisch sind, wie z.B. Aktivitätsmessungen und vorläufige Quantifizierungen, beruht fundierteres Wissen auf fortgeschritteneren Studien des Enzyms, die nur mit reinen Enzymproben durchgeführt werden können. Reine Enzyme bedeuten auch einfachere Tests mit weniger Störungen. Einige Analysemethoden, wie z.B. Kristallographie, sind empfindlich gegenüber der Probenreinheit und liefern nur bei höchster Probenreinheit die gewünschten Ergebnisse. Bei der großtechnischen Produktion für industrielle Anwendungen ist die Enzymreinigung direkt mit der Produktqualität verbunden, zusätzlich zu den regulatorischen Anforderungen. Daher muss die Enzymreinigung gründlich überlegt und vorsichtig durchgeführt werden, sowohl für Forschungs- als auch für Produktionszwecke. Die Aufgabe ist jedoch nicht einfach. Viele Faktoren können die Effizienz, den Ertrag und die Stabilität der Aktivität während der Reinigung verändern, und die Auswirkungen dieser Faktoren variieren stark von einem Enzym zum anderen. Bei Creative Enzymes verlassen wir uns auf die sachkundigen Wissenschaftler und deren jahrelange Erfahrung, um den geeignetsten Reinigungsprozess für jedes Enzym zu entwerfen und durchzuführen. Wir verstehen, dass die Kunden in verschiedenen Fällen unterschiedliche Präferenzen hinsichtlich Reinheit, Ertrag und Stabilität haben können, und wir werden den Reinigungsprozess weiter anpassen, um diesen Bedürfnissen gerecht zu werden.

Beinahe alle Proben müssen vor der eigentlichen Reinigung vorbereitet werden. Für die Enzyme aus Zellquellen müssen sie vor der Reinigung in Komponenten fraktioniert werden. Der erste Schritt umfasst normalerweise die Homogenisierung von Zellen, die die Zellwand aufbricht, um das Enzym in das Homogenat freizusetzen, zusammen mit anderen Komponenten. Je nach Zelltyp kann die Homogenisierung einfach sein, wie im Fall von Säugetiergewebe ohne starre Zellwand, oder sie kann härtere Bedingungen wie Abrieb, Gefrieren und hohen Druck erfordern, aufgrund der starren Zellwand des Pflanzengewebes. Manchmal werden zusätzliche hydrolytische Enzyme oder Detergenzien hinzugefügt, um eine bessere Extraktion zu erzielen. Die Mischung wird dann durch Zentrifugation fraktioniert, wobei ein dichter Pellet schwerer Materialien am Boden des Zentrifugenröhrchens und ein leichterer Überstand darüber entsteht (Abbildung 1). Der Überstand wird erneut mit größerer Kraft zentrifugiert, um einen weiteren Pellet und Überstand zu erhalten. Das Verfahren, das als differentielle Zentrifugation bezeichnet wird, liefert mehrere Fraktionen mit abnehmender Dichte, von denen jede noch Hunderte von verschiedenen Proteinen enthält, die anschließend auf die zu reinigende Aktivität getestet werden. In der Regel wird eine Fraktion für eine solche Aktivität angereichert, und sie dient dann als Materialquelle, auf die diskriminierendere Reinigungstechniken angewendet werden. Die Wahl von Temperatur, pH-Wert, Puffer-Salz, Pufferstärke, ionischer Stärke, Osmolarität, Zusatzstoffen (EDTA, SDS, nichtionische Detergenzien usw.) und Homogenisierungstechnik sind entscheidend für den Erfolg der Reinigung.

Abbildung 1. Differentielle Zentrifugation.
Referenz: Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Biochemie. 5. Auflage. New York: W H Freeman; 2002. Abschnitt 4.1

Die Reinigung und Trennung von Enzymen basiert im Allgemeinen auf Löslichkeit, Größe, Polarität und Bindungsaffinität. Der Produktionsmaßstab, der Zeitrahmen und die Eigenschaften der Enzyme sollten alle berücksichtigt werden, wenn die geeignete Trennmethode ausgewählt wird.

• Löslichkeitsbasierte Trennung

Das Prinzip dieser Art der Trennung ist, dass die Löslichkeit des Enzyms drastisch variiert, wenn sich pH-Wert, ionische Stärke oder die dielektrische Konstante ändern. Zum Beispiel sind die meisten Proteine bei hohen Salzkonzentrationen weniger löslich, ein Effekt, der als Ausfällen bezeichnet wird. Die Salzkonzentration, bei der ein Protein ausfällt, variiert von Protein zu Protein. Daher kann das Ausfällen verwendet werden, um Proteine zu fraktionieren. Das Ausfällen ist auch nützlich, um verdünnte Lösungen von Proteinen, einschließlich aktiver Fraktionen, die aus anderen Reinigungsschritten gewonnen wurden, zu konzentrieren. Die Zugabe von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln wie Ethanol oder Aceton verändert die dielektrische Konstante des Lösungsmittels und fällt daher das gewünschte Enzym aus. Neutrale wasserlösliche Polymere können auch zu demselben Zweck anstelle von organischen Lösungsmitteln verwendet werden. Es müssen jedoch die Risiken des Verlusts der Enzymaktivität während der Fällung und der weiteren Trennung des hinzugefügten Salzes oder Polymers berücksichtigt werden.

• Größen- oder massenbasierte Methode

Da Enzyme relativ große Moleküle sind, begünstigt die Trennung basierend auf der Größe oder Masse der Moleküle die Reinigung von Enzymen, insbesondere von solchen mit hohem Molekulargewicht. Dialyse ist eine häufig verwendete Methode, bei der semipermeable Membranen verwendet werden, um Salze, kleine organische Moleküle und Peptide zu entfernen (Abbildung 2). Der Prozess benötigt normalerweise ein großes Volumen Dialysat, die Flüssigkeit außerhalb des Dialysebeutels, und einen Zeitraum von Stunden oder Tagen, um das Gleichgewicht zu erreichen. Gegenstromdialyse-Kartuschen können ebenfalls verwendet werden, bei denen die zu dialysierende Lösung in eine Richtung fließt und das Dialysat in die entgegengesetzte Richtung außerhalb der Membran. Ähnlich können Ultrafiltrationsmembranen, die aus Celluloseacetat oder anderen porösen Materialien bestehen, verwendet werden, um ein Enzym zu reinigen und zu konzentrieren, das größer als ein bestimmtes Molekulargewicht ist. Das Molekulargewicht wird als Molekulargewicht-Ausschluss bezeichnet und ist in einem großen Bereich von verschiedenen Membranen verfügbar. Der Ultrafiltrationsprozess wird normalerweise in einer Kartusche durchgeführt, die mit dem zu reinigenden Enzym beladen ist. Zentrifugalkraft oder Vakuum wird angewendet, um den Prozess zu beschleunigen. Sowohl Dialyse als auch Ultrafiltration sind schnell, aber etwas ungenau bei der Unterscheidung des Molekulargewichts, während die Größenausschlusschromatographie eine feine Fraktionierung aus der Rohmischung ermöglicht, wodurch die Trennung des gewünschten Enzyms nicht nur von kleinen Molekülen, sondern auch von anderen Enzymen und Proteinen ermöglicht wird. Die Größenausschlusschromatographie, auch bekannt als Gel-Filtrationschromatographie, beruht auf Polymerperlen mit definierten Porengrößen, die Partikel kleiner als eine bestimmte Größe in die Perle lassen und somit deren Austritt aus einer Säule verlangsamen. Im Allgemeinen gilt: Je kleiner das Molekül, desto langsamer kommt es aus der Säule. Größenausschlussharze sind relativ „steif“ und können in Hochdrucksäulen bei höheren Durchflussraten verwendet werden, was die Trennzeit verkürzt. Andere Faktoren wie die Porengröße, die Proteinform, das Säulenvolumen und die ionische Stärke des Eluats können ebenfalls das Ergebnis der Reinigung beeinflussen.

Abbildung 2. Das Schema der Dialyse. Enzymmoleküle (rote Punkte) werden im Dialysebeutel zurückgehalten und von anderen kleineren Molekülen (blaue Punkte) getrennt.
Referenz: Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Biochemie. 5. Auflage. New York: W H Freeman; 2002. Abschnitt 4.1

• Polaritätsbasierte Trennung

Wie andere Proteine können Enzyme auf der Grundlage der Polarität, genauer gesagt ihrer Nettoladung, Ladungsdichte und hydrophoben Wechselwirkungen getrennt werden. In der Ionenaustauschchromatographie wird eine Säule mit Perlen verwendet, die negativ oder positiv geladene funktionelle Gruppen enthalten, um Enzyme zu trennen. Kationische Enzyme können auf anionischen Säulen und anionische Enzyme auf kationischen Säulen getrennt werden.

Elektrophorese ist ein Verfahren, das ein elektrisches Feld nutzt, um das Eindringen von Ionen durch eine feste oder halbfeste Matrix oder Oberfläche zu bewirken, was zu Trennungen der Bestandteile auf der Grundlage der Ladungsdichte führt. Die am häufigsten verwendeten Methoden mit einer SDS-PAGE-Matrix sind ziemlich gut standardisiert und unterscheiden sich nicht viel zwischen den Laboren. Die Distanz, die ein Protein in SDS-PAGE wandert, ist umgekehrt proportional zum Logarithmus seines molekularen Radius, der ungefähr proportional zum Molekulargewicht ist. Ähnlich kann eine Matrix mit gradienten pH-Wert in der isoelektrischen Fokussierungstrennung verwendet werden. Ein Protein bewegt sich unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes und stoppt, wenn es den pH-Wert erreicht, der der pI für das Protein ist (Nettoladung = 0). Die verwendete Matrix kann flüssig oder ein Gel sein, das entweder in zylindrischer Form oder auf einer flachen Platte gegossen wird.

Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) nutzt hydrophobe Wechselwirkungen, um verschiedene Enzyme zu unterscheiden, die auf Matrizen wie Octyl- oder Phenyl-Sepharose adsorbiert sind. Ein Gradient abnehmender ionischer Stärke oder möglicherweise zunehmender Konzentration unpolarer Lösungsmittel kann verwendet werden, um die Proteine zu eluieren, wobei Fraktionen entstehen, die normalerweise relativ reine Enzyme enthalten. Die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) verwendet dasselbe Prinzip der Trennung wie HIC, das mit feiner verteilten und abgestimmten Materialien gefüllt ist und somit mehr Auswahlmöglichkeiten für Eluenten ermöglicht und zu besseren Trennungen führt. Beachten Sie, dass HPLC auf Polarität, Affinität oder beidem basieren kann.

• Affinitäts- oder ligandbasierte Reinigung

Affinitätschromatographie ist ein weiteres leistungsstarkes und allgemein anwendbares Mittel zur Reinigung von Enzymen. Diese Technik nutzt die hohe Affinität vieler Enzyme für spezifische chemische Gruppen. Im Allgemeinen kann die Affinitätschromatographie effektiv verwendet werden, um ein Protein zu isolieren, das eine bestimmte Gruppe erkennt, indem (1) diese Gruppe oder ein Derivat davon kovalent an eine Säule gebunden wird, (2) eine Mischung von Proteinen zu dieser Säule hinzugefügt wird, die dann mit Puffer gewaschen wird, um ungebundene Proteine zu entfernen, und (3) das gewünschte Protein durch Zugabe einer hohen Konzentration einer löslichen Form der Affinitätsgruppe oder durch Ändern der Bedingungen zur Verringerung der Bindungsaffinität eluieren wird. Die Affinitätschromatographie ist am effektivsten, wenn die Wechselwirkung des Enzyms mit dem Molekül, das als Köder verwendet wird, hochspezifisch ist. Ein spezielles Beispiel für die Ligand-Affinitätschromatographie ist die Ni-NTA (Nickel – Nitrolotriessigsäure-Agarose) Affinitätschromatographie. Dieses Ligand bindet fest an ein 6-Aminosäure-Peptid, das nur aus Histidinen (His6) besteht. Die cDNA-Sequenz für His6 kann an die cDNA angehängt werden, die für ein bestimmtes rekombinantes Protein kodiert, wodurch ein rekombinantes Protein entsteht, das ein His-TAG enthält. Dies ermöglicht die Affinitätsreinigung eines solchen Proteins unter Verwendung von Ni-NTA, ohne eine spezielle Ligand-Affinitäts-Säule entwerfen zu müssen. Andere Formen der Affinitätschromatographie umfassen Farbstoff-Ligand-Chromatographie, Immunadsorptionschromatographie und kovalente Chromatographie.

Nach der Reinigung müssen die Enzyme konzentriert und manchmal lyophilisiert werden, um die reine, stabile Form zu erhalten, die als Produkt verteilt oder in die endgültige Formulierung eingefügt wird. Die folgende Analyse und Qualitätszertifizierung ist notwendig, um zu bestätigen, dass das Enzym das gewünschte ist, mit angemessener Konzentration, Stabilität und Aktivität. Die Anreicherung und Zertifizierung erfordert erfahrene Forscher, um die Enzymqualität aufrechtzuerhalten und die richtige Charakterisierungsmethode auszuwählen.

Creative Enzymes bedient die Enzymindustrie seit Jahren, um die Bedürfnisse der Enzymreinigung von verschiedenen Kunden zu erfüllen. Unsere Dienstleistungen zeichnen sich durch hohe Reinheit, schnelle Durchlaufzeiten und professionelle technische Unterstützung aus. Bitte kontaktieren Sie uns bei Fragen und Anfragen zu unseren hoch bewerteten Dienstleistungen:

• Enzymreinigung
• Affinitäts-Säule für markierte Enzyme (GST, Ni-NTA, Protein A/G/L Harze usw.)
• Immunpräzipitation (IP)
• Ionenaustausch (IEC)
• Größenausschluss (SEC) und Gel-Filtration (GF)
• Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)
• Elektrophorese
• Löslichkeitsbasierte Reinigung
• Löslichkeit von Einschlusskörperchen
• Enzymrückgewinnung und -faltung
• Endotoxinentfernung
• Qualitätskontrolle
• Enzymcharakterisierung
• Enzymqualitätszertifizierung