Bestimmung und Messung der Inhibitoraktivität

Anfrage

Die genaue Bestimmung der Inhibitoraktivität ist ein entscheidender Schritt in Hochdurchsatz-Screening-Workflows und der anschließenden Inhibitorentwicklung. Bei Creative Enzymes bieten wir präzise, reproduzierbare und umfassende Messungen der inhibitorischen Effekte über eine Vielzahl von Enzymklassen hinweg. Durch den Einsatz von Goldstandard-Methoden, moderner Instrumentierung und sorgfältig validierten Assay-Designs liefern unsere Dienstleistungen quantitative Daten zu Potenz, Spezifität und Wirkmechanismus der Inhibition. Diese Ergebnisse unterstützen unsere Kunden dabei, die vielversprechendsten Kandidaten für die weitere Optimierung und Anwendung zu identifizieren.

Inhibitoraktivitätsbestimmung: Der Schritt nach dem HTS

Während Hochdurchsatz-Assays effektiv potenzielle Treffer identifizieren, können nur detaillierte Aktivitätsmessungen zwischen schwachen, unspezifischen Bindern und echten Leitstrukturen unterscheiden. Die Bestimmung der Inhibitoraktivität umfasst nicht nur die Quantifizierung der Hemmstärke, sondern auch das Verständnis, wie Inhibitoren mit Enzymen unter physiologisch oder industriell relevanten Bedingungen interagieren.

Determination and measurement of enzyme inhibitor activity Abbildung 1: Hemmung der Enzymaktivität—% Aktivität vs. log [Inhibitor].

Traditionelle Bewertungsmethoden können, wenn sie schlecht konzipiert sind, aufgrund von Variabilität der Assay-Bedingungen, geringer Sensitivität oder mangelnder Reproduzierbarkeit zu irreführenden Ergebnissen führen. Um diese Herausforderungen zu überwinden, ist eine spezialisierte Plattform erforderlich, die genaue Kinetik, mechanistische Informationen und vergleichende Analysen bietet.

Creative Enzymes vereint enzymologisches Fachwissen, modernste Analytik und strenge Qualitätskontrolle, um verlässliche Messungen bereitzustellen, die sowohl Forschungs- als auch Entwicklungsprozesse unterstützen.

Unsere zuverlässigen Serviceangebote

Unser Service zur Bestimmung und Messung der Inhibitoraktivität ist darauf ausgelegt, detaillierte, quantitative und reproduzierbare Bewertungen der Inhibitorleistung zu liefern.

Unsere Dienstleistungen

Service	Beschreibung
Potenzbewertung	Bestimmung von IC₅₀-, EC₅₀- und K_i-Werten mittels standardisierter Dosis-Wirkungs-Kurven. Anwendung nichtlinearer Regressionsmodelle zur genauen Parameterschätzung.
Kinetische Charakterisierung	Michaelis–Menten- und Lineweaver–Burk-Analysen zur Bestimmung kinetischer Konstanten (K_M, V_max, k_cat). Unterscheidung von kompetitiven, nicht-kompetitiven, unkompetitiven und gemischten Hemmungsmechanismen.
Selektivitäts- und Spezifitätstests	Cross-Screening gegen verwandte Enzymfamilien zur Erkennung von Off-Target-Effekten. Multi-Enzym-Profiling für Kunden, die hochselektive Inhibitoren suchen.
Stabilitäts- und Robustheitsstudien	Bewertung der Inhibitoraktivität über verschiedene Temperaturen, pH-Bedingungen und Kofaktoren hinweg. Testung in komplexen biologischen Matrizes (z. B. Zelllysate, Serum) für translationale Relevanz.
Fortschrittliche Analytikmethoden	Spektrophotometrische, fluorometrische und lumineszenzbasierte Ausleseverfahren. Markierungsfreie Technologien wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und Biolayer-Interferometrie (BLI). Massenspektrometrie-basierte Aktivitätsassays für hohe Sensitivität und Präzision.

Lieferumfang

Roh- und verarbeitete Aktivitätsdaten mit vollständiger Rückverfolgbarkeit.
IC₅₀-, K_i-, K_M- und V_max-Werte, gestützt durch klare Dosis-Wirkungs-Kurven.
Vergleichende Inhibitor-Rankings und Selektivitätsprofile.
Mechanismus-bezogene Einblicke (kompetitive vs. allosterische Hemmung).
Ein umfassender Abschlussbericht mit detaillierten Assay-Bedingungen, Reproduzierbarkeitsmetriken und Empfehlungen für weitere Studien.

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Unsere Vorteile

Umfassende Methodik

Ein vollständiges Spektrum analytischer Techniken gewährleistet Flexibilität und Genauigkeit.

Hohe Sensitivität und Präzision

Fortschrittliche Instrumentierung minimiert Variabilität und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Mechanistische Einblicke

Über Potenzwerte hinaus liefern wir detaillierte Informationen zu Hemmungsmechanismen.

Individuell anpassbare Testbedingungen

Assays, die auf spezifische Enzyme, Branchen oder physiologische Umgebungen zugeschnitten sind.

Strenge Qualitätskontrolle

Replikate, Kontrollen und orthogonale Methoden sichern die Datenzuverlässigkeit.

Nahtlose Integration

Sanfte Anbindung an vorgelagerte HTS-Services und nachgelagerte SAR-Analysen.

Fallstudien und Anwendungen aus der Praxis

Fall 1: Messung der inhibitorischen Aktivität von Pankreas-Lipase-Inhibitoren

In dieser Studie wurde die Hemmung der Pankreas-Lipase (PL) durch aus der Wurzel von Andrographis paniculata isolierte Verbindungen zur Untersuchung des Anti-Adipositas-Potenzials untersucht. Mittels HPLC-Mikrofraktionierung und in vitro-Assays zeigten mehrere Phytochemikalien signifikante inhibitorische Aktivität mit IC₅₀-Werten von 4,46–21,76 μg/mL. Unter ihnen war 7-O-Methyl-Dihydro-Wogonin (MDHW) am potentesten (IC₅₀ = 14,86 μM) und zeigte zudem Synergie mit Orlistat. Kinetische Studien ergaben eine kompetitive Hemmung (K_i = 7,4 μM), wobei hydrophobe Bindung durch Spektroskopie und molekulares Docking bestätigt wurde. Strukturanalysen zeigten zudem stabile MDHW-PL-Interaktionen, was seine hohe inhibitorische Potenz und sein Potenzial als pharmazeutischer oder nutrizeutischer Anti-Adipositas-Wirkstoff unterstreicht.

Isolation and mechanistic study of a potent lipase inhibitor from Andrographis paniculata roots Abbildung 2. (A) Hemmung der PL-Aktivität durch MDHW und Orlistat bei pH 8,0, 298 K, c(PL) = 5 µM, c(4-MUO) = 0,25 mM. (B) Reversibilität der MDHW-Hemmung bei unterschiedlichen Konzentrationen. (C) Lineweaver–Burk-Plots mit Inset Steigung vs. [MDHW]. (D) Dosis-Wirkungskurven von MDHW und Orlistat auf PL. (E) Fa–Cl-Plots für die MDHW–Orlistat-Kombination. (F) Struktur von 7-O-Methyl-Dihydrowogonin (MDHW). (Gaur et al., 2023)

Fall 2: Messung der inhibitorischen Aktivität von Selamectin gegen DprE1 in Mykobakterien

Selamectin, ein Avermectin mit anti-mykobakterieller Aktivität, wurde hinsichtlich seiner Hemmwirkung auf Mycobacterium tuberculosis untersucht. Mutantenstämme mit verändertem DprE1, einem Enzym der Arabinogalactan-Synthese, zeigten erhöhte Empfindlichkeit, was auf ein potenzielles Target hindeutet. Biochemische Assays bestätigten die Bindung von Selamectin an DprE1, während Docking-Studien eine Schleifenregion nahe Leu275 als Interaktionsstelle identifizierten. Sequenzalignments verknüpften Restvariationen mit MIC-Werten, was teilweise in konstruierten M. smegmatis-Mutanten bestätigt wurde. Metabolisches Labeling bestätigte jedoch keine typischen DprE1-Hemmungsprofile. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Selamectin in vitro mit DprE1 interagiert, in vivo jedoch über mehrere Targets wirken könnte.

Selamectin identified as a novel dpre1 enzyme inhibitor in Mycobacterium tuberculosis Abbildung 3. Dosis-Wirkungshemmung von DprE1 durch Selamectin. IC₅₀-Bestimmung von Selamectin gegen Wildtyp (■), L282F (●) und L282V (▲) M. smegmatis DprE1. (Ezquerra-Aznárez et al., 2022)

FAQs zur Messung der Inhibitoraktivität

F: Welche Parameter können Sie messen?

A: Wir liefern IC₅₀-, EC₅₀- und K_i-Werte sowie kinetische Konstanten wie K_M, V_max und k_cat. Zusätzlich bewerten wir Stabilität, Selektivität und Wirkmechanismus des Inhibitors unter verschiedenen Bedingungen.
F: Welche Assay-Formate stehen zur Verfügung?

A: Wir bieten spektrophotometrische, fluorometrische, lumineszente und markierungsfreie Methoden (SPR, BLI) sowie massenspektrometriebasierte Assays für hohe Sensitivität an. Das Assay-Format wird je nach Enzymklasse, Inhibitor-Eigenschaften und Kundenwunsch ausgewählt.
F: Wie stellen Sie Genauigkeit und Reproduzierbarkeit sicher?

A: Alle Assays werden mit geeigneten Kontrollen, Replikaten und Referenzstandards validiert. Wir berechnen Z′-Faktoren und andere statistische Qualitätsmetriken zur Bestätigung der Zuverlässigkeit. Bei Bedarf werden auch orthogonale Assays eingesetzt.
F: Können die Testbedingungen angepasst werden?

A: Ja. Wir passen die Assay-Bedingungen an die Kundenanforderungen an, einschließlich physiologischer (pH, Kofaktoren, Temperatur) oder industrieller Umgebungen (organische Lösungsmittel, hohe Temperaturen). So wird die Relevanz der Daten für reale Anwendungen sichergestellt.
F: Wie werden falsch-positive Ergebnisse oder Artefakte adressiert?

A: Falsch-positive Ergebnisse werden durch wiederholte Tests, Einbeziehung geeigneter Leerproben und Kontrollen sowie Bestätigung durch orthogonale Assay-Formate minimiert. Unsere Datenanalyse-Pipelines sind darauf ausgelegt, Ergebnisse mit geringer Zuverlässigkeit herauszufiltern.
F: Welche Ergebnisse erhalte ich?

A: Kunden erhalten vollständige Rohdaten, verarbeitete Datensätze, Dosis-Wirkungs-Kurven, berechnete Parameter (IC₅₀, K_i usw.) und einen detaillierten Abschlussbericht. Empfehlungen für nächste Schritte, einschließlich SAR-Analyse oder mechanistischer Studien, werden ebenfalls bereitgestellt.

Referenzen:

Ezquerra-Aznárez JM, Degiacomi G, Gašparovič H, et al. The veterinary anti-parasitic selamectin is a novel inhibitor of the Mycobacterium tuberculosis Dpre1 enzyme. IJMS. 2022;23(2):771. doi:10.3390/ijms23020771
Gaur P, Khan F, Shanker K. Potential lipase inhibitor from underutilized part of Andrographis paniculata: Targeted isolation and mechanism of inhibition. Industrial Crops and Products. 2023;197:116623. doi:10.1016/j.indcrop.2023.116623

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Projektbeschreibung:

Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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