Domänen- und Schleifenengineering zur rationalen Enzymoptimierung

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Kreative Enzyme Angebote Domänen- und Schleifeningenieurdienste als Teil unserer umfassenden Plattform für Rationale EnzymoptimierungDurch die Fokussierung auf die strukturelle Dynamik von Proteindomänen und flexiblen Schleifen rekonstruieren wir Enzyme rational, um überlegene Aktivität, Stabilität, Spezifität oder Substratanpassungsfähigkeit zu erreichen. Mithilfe fortschrittlicher computergestützter Modellierung, struktureller Analyse und molekularer Simulation identifizieren und modifizieren unsere Experten Domänenschnittstellen oder Schleifenregionen, die die konformationale Flexibilität und Katalyse von Enzymen steuern.

Dieser Service bietet einen präzisen, mechanismusbasierten Ansatz zur Verbesserung von Enzymen – ideal für Projekte, bei denen traditionelle Mutagenese-Ansätze an ihre Grenzen gestoßen sind.

Verstehen von Domain- und Loop-Engineering

Enzyme sind modulare molekulare Maschinen, die aus unterschiedlichen Domänen und flexiblen Schleifen bestehen und zusammenarbeiten, um die Katalyse voranzutreiben. Während katalytische Rückstände im aktiven Zentrum entscheidend sind, bestimmen die Bewegungen und Wechselwirkungen von Domänen und Schleifen oft den Zugang zum Substrat, die Freisetzung des Produkts und die Stabilität unter verschiedenen Bedingungen.

Domänenengineering beinhaltet das Modifizieren, Tauschen oder Umorientieren ganzer struktureller Domänen, um neue katalytische Eigenschaften, Substratbindungsmerkmale oder allosterische Kontrolle einzuführen. Schleifenengineeringandererseits passt die Feinabstimmung die dynamischen Elemente in der Nähe oder innerhalb aktiver Stellen an – indem die Schleifenlänge, Flexibilität oder Zusammensetzung der Reste angepasst wird, um die Substratanpassung, Reaktionsgeschwindigkeit oder thermische Stabilität zu verbessern.

Principle of domain swapping for rational enzyme optimization Abbildung 1. Schematische Darstellung des Domänen-Swappens, einer Art der Domänenbearbeitung. (Adaptierte von Nandwani) u. a.., 2019)

Loop engineering for rational enzyme optimization Abbildung 2. Deckelschleifen in Enzymen. (Adaptiert von Barozet) u. a.., 2021)

Die rationale Gestaltung dieser Regionen, geleitet durch computergestützte Modellierung und Bioinformatik, ermöglicht eine gezielte Verbesserung, ohne die strukturelle Integrität zu gefährden. Durch unseren Service zur Domänen- und Schleifenoptimierung wendet Creative Enzymes strukturbasierte Algorithmen, molekulare Dynamik-Simulationen und experimentelle Validierung an, um optimierte Enzyme mit vorhersehbarer und robuster Leistung zu entwickeln.

Unsere Strategien zur Optimierung von Domänen und Schleifen wurden erfolgreich auf eine breite Palette von Enzymklassen angewendet, einschließlich Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen und Ligasen – und dienen vielfältigen Anwendungen in der pharmazeutischen Herstellung, der grünen Chemie und der industriellen Biotechnologie.

Domänen- und Schleifenengineering: Dienstleistungen und Kapazitäten

Creative Enzymes bietet umfassende Lösungen für das Domain- und Loop-Engineering, indem wir rationales computergestütztes Design mit experimenteller Verifizierung kombinieren. Unser Angebot umfasst:

Strukturanalyse und Zielidentifikation

Detaillierte Kartierung von Domänengrenzen und Schleifenregionen unter Verwendung von strukturellen und sequenziellen Daten.
Identifizierung flexibler, instabiler oder katalytisch relevanter Schleifen zur Modifikation.
Domäneninteraktionsanalyse zur Erkennung von Regionen, die die Faltung von Enzymen, Allosterie oder Multimerisierung beeinflussen.

Computational Design von Domänen- und Schleifenvarianten

Molekulardynamik (MD) Simulationen zur Analyse der konformationellen Flexibilität und der Bewegungen von Domänen.
Energie-Landschaft und Analyse der Rückstandsinteraktionen zur Identifizierung von Schlüsselstabilisierungs- oder beweglichen Regionen.
In silico Entwurf von Varianten der Schleifenlängen oder Modellen zur Domänenrekombination für verbesserte Funktionen.

Domänenwechsel und Rekombination

Rationale Ersetzung oder Fusion von Domänen homologer Enzyme, um neuartige Aktivitäten oder Spezifitäten einzuführen.
Entwurf von Inter-Domain-Linkern für optimales Falten und Kommunikation zwischen katalytischen Regionen.
Bewertung der Stabilität und Funktion mittels computergestützter Docking- und Faltungssimulationen.

Schleifenmodifikation und -optimierung

Gezielte Veränderung der Schleifenlänge, Ladungsverteilung und Hydrophobizität zur Verbesserung der Katalyse.
Einfügung, Löschung oder Substitution von Schleifenrückständen, geleitet durch molekulare Modellierung.
Optimierung flexibler Schleifen für verbesserte Thermostabilität, Substrataufnahme oder Umsatzrate.

Experimenteller Bau und Screening

Standortgerichtete oder rekombinationsbasierte Mutagenese zur Modifikation von Schleifen/Domänen.
Expression, Reinigung und kinetische Tests von entworfenen Varianten.
Hochdurchsatz-Screening für verbesserte Aktivität und Stabilität.

Strukturelle und funktionale Validierung

Zirkuläre Dichroismus (CD), differenzielle Scanning-Fluorimetrie (DSF) und Enzymkinetik-Analyse.
Optionale Kristallisation und rechnerische Verfeinerung zur Bestätigung von konstruierten strukturellen Veränderungen.

Service-Workflow

Service workflow of enzyme domain and loop engineering at Creative Enzymes

Lieferbare Ergebnisse

Modul	Liefergegenstände
Strukturelle Modellierung & Analyse	3D-Modell, Bericht über Domänen-/Schleifenabbildung
Domänen- und Schleifendesign	Variantenvorschläge, Energiebewertung
Simulation und Validierung	MD-Simulationsbericht, Stabilitätsvorhersage
Mutagenese & Expression	Verifizierte Klone, gereinigte Enzyme
Funktionale Charakterisierung	Kinetische Daten, Stabilitätsanalyse
Abschlussbericht	Umfassende Ergebnisse, Empfehlungen

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Warum Creative Enzymes wählen?

Umfassende Expertise im rationalen Design

Wir integrieren fortschrittliche computergestützte Methoden mit praktischer Enzymbiochemie und stellen sicher, dass jede entwickelte Variante wissenschaftlich fundiert und experimentell verifiziert ist.

Tiefe strukturelle Einsicht

Unser Team ist auf die Struktur-Funktions-Beziehungen von Enzymen spezialisiert und konzentriert sich auf flexible Regionen, die oft von der Standard-Mutagenese übersehen werden.

Hochpräzise computergestützte Modellierung

Wir nutzen modernste molekulare Dynamik-Simulationen und energiebasierte Algorithmen, um realistische Enzymkonformationen und deren Leistung vorherzusagen.

Maßgeschneiderte, zielorientierte Designs

Jedes Projekt wird individuell angepasst, um die spezifischen Anforderungen der Kunden zu erfüllen, von der Verbesserung der Enzymstabilität bis hin zur Entwicklung von Multi-Domain-Fusionskatalysatoren.

Nahtlose Integration mit anderen Ingenieurdienstleistungen

Domänen- und Schleifeningenieurprojekte können durch computergestützte Modellierung, Mutagenese und Expressionsdienste innerhalb desselben Workflows ergänzt werden.

Verpflichtung zu Vertraulichkeit und Qualität

Wir gewährleisten Datenintegrität, Reproduzierbarkeit und vollständige Vertraulichkeit der Kunden in jeder Phase des Projekts.

Vertretende Fallstudien

Fall 1: Verbesserte Niedertemperatur-Xylanase durch semi-rationale Gestaltung

Xylanase spielt eine entscheidende Rolle beim Abbau von lignocellulosehaltiger Biomasse zusammen mit Cellulase. Um seine Leistung bei niedrigen Temperaturen zu verbessern, wurde ein struktur-basiertes semi-rationales Design angewendet, um Bispora sp. MEY-1 XYL10C_∆N. Unter den getesteten Varianten zeigte der M53S/F54L/N207G-Mutant eine 2,9-fache Erhöhung der spezifischen Aktivität und eine 2,8-fache höhere katalytische Effizienz bei 40°C im Vergleich zum Wildtyp, zusammen mit verbesserter Thermostabilität (Schmelztemperatur +7,7°C). In Kombination mit Cellulase erhöhte der Mutant die Ausbeuten an reduzierenden Zuckern aus Maisstängeln, Weizenkleie und Maiskolben um bis zu das 1,9-Fache. Die Studie identifiziert Loop2 als entscheidenden Faktor für die kälteaktive Effizienz und das industrielle Potenzial.

Improvement of XYL10C_∆N catalytic performance through loop engineering for lignocellulosic biomass utilization in feed and fuel industries Abbildung 3. Strukturanalyse in Bezug auf die katalytische Effizienz. Die Bilder A und B zeigen die Bestätigungen und Wechselwirkungen zwischen Xyloheptaose und den Rückständen im katalytischen Tunnel von XYL10C_∆N und dessen Mutante M53S/F54L/N207G; C Bindungsfreiheitsenergiewerte von XYL10C_∆N und der Mutante M53S/F54L/N207G wurden unter Verwendung der molekularen Mechanik Poisson-Boltzmann-Oberflächenfläche berechnet. u. a.., 2021)

Fall 2: Domänenwechsel zur Veränderung der Enzymspezifität

Diese Studie untersuchte das Austauschen von Proteindomänen als Strategie zur Modifizierung der Substratspezifität von Enzymen und zum Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehungen in homologen Proteinen. Zwei chimäre Enzyme, AAM7 und PAR, wurden durch das Einfügen funktioneller Domänen zwischen einer Carboxylesterase (AFEST) und einer Acylpeptid-Hydrolase (apAPH), beide thermophile α/β-Hydrolasen, erstellt. Eine sorgfältige Auswahl der Splicing-Stellen und die Optimierung der Schnittstellen minimierten strukturelle Störungen. Beide Chimären behielten die Thermostabilität und zeigten Substratpräferenzen, die ihren jeweiligen Elternenzymen ähnlich waren – AAM7 für kurzkettige (pNPC4) und PAR für mittelkettige (pNPC8) Ester. Die Ergebnisse zeigen, dass die Substratbindungsdomäne hauptsächlich die Enzymspezifität bestimmt, während optimierte Schnittstellen eine erfolgreiche Domänenfusion gewährleisten.

Alteration of substrate specificities of thermophilic α/β hydrolases through domain swapping and domain interface optimization Abbildung 4. Die Strukturen der Eltern AFEST (rot, PDB ID: 1JJI) und apAPH (blau, PDB ID: 1VE6) sowie die Modellstrukturen der Chimären PA, AA. Die Kreuzungspunkte sind angegeben. (Zhou u. a.., 2012)

Domänen- und Schleifenengineering: Häufig gestellte Fragen

Was ist der Unterschied zwischen Domänenengineering und Schleifenengineering?

A: Die Domänenengineering konzentriert sich auf die Modifizierung oder den Austausch ganzer struktureller Regionen, die unterschiedliche biochemische Funktionen erfüllen, während das Loop-Engineering kurze, flexible Regionen anvisiert, die strukturelle Elemente verbinden und die Flexibilität, Katalyse und Stabilität von Enzymen beeinflussen.
Q: Können Sie in einem Projekt sowohl rechnerische als auch experimentelle Arbeiten durchführen?

A: Ja. Wir bieten vollständig integrierte Arbeitsabläufe – von computergestütztem Modellieren und Simulieren bis hin zu experimenteller Mutagenese, Expression und biochemischer Validierung.
Q: Welche Arten von Daten werden benötigt, um ein Projekt zu starten?

A: Wir können mit einer Proteinsequenz, einer bekannten Kristallstruktur oder einem Homologiemodell beginnen. Wenn keine verfügbar sind, kann unser Team eine Sequenzanpassung und Modellerstellung unter Verwendung von Datenbanken und prädiktiven Algorithmen durchführen.
F: Welche Enzym-Eigenschaften können mit diesem Service verbessert werden?

Unsere Ansätze in der Domänen- und Schleifeningenieurwissenschaft können die Aktivität, Stabilität, Substratspezifität, Kofaktorpräferenz, pH-Toleranz und thermodynamische Robustheit verbessern.
F: Wie sagen Sie voraus, welche Schleifen oder Bereiche modifiziert werden sollten?

Wir wenden molekulare Dynamik-Simulationen, Energiemapping und Analysen der evolutionären Erhaltung an, um strukturell kritische oder flexible Regionen zu identifizieren, die am ehesten von einer Modifikation profitieren könnten.
F: Wie lange dauert der gesamte Prozess?

A: Je nach Komplexität dauert ein vollständiger Design-Validierungszyklus typischerweise 6–10 Wochen, einschließlich computergestützter Analyse, Mutagenese, Expression und Charakterisierung.
Q: Halten Sie die Vertraulichkeit der Kunden ein?

A: Absolut. Alle Kundendaten, Sequenzen und Ergebnisse werden unter strengen Vertraulichkeitsvereinbarungen behandelt und während des gesamten Projektlebenszyklus sicher gespeichert.
F: Können optimierte Enzyme durch andere Dienstleistungen von Creative Enzymes weiter verbessert werden?

A: Ja. Wir bieten an gerichtete Evolution, gerichtete Mutagenese, computational modelingund strukturelle Analyse-Dienstleistungen, die das Domänen- und Schleifenengineering für maximale Optimierung ergänzen können.

Referenzen:

Barozet A, Chacón P, Cortés J. Aktuelle Ansätze zur Modellierung flexibler Schleifen. Aktuelle Forschung in der Strukturbiologie. 2021;3:187-191. doi:10.1016/j.crstbi.2021.07.002
Nandwani N, Surana P, Negi H, u. a.Ein Fünf-Rest-Motiv für das Design von Domänentausch in Proteinen. Nat Commun2019;10(1):452. doi:10.1038/s41467-019-08295-x
Lied C, Gu J, Ren H, u. a.Loop-Engineering in Enzymen von Struktur zu Funktion: Mechanismen, Methoden und Ingenieurstrategien. Biotechnologie-Fortschritte. 2025;85:108716. doi:10.1016/j.biotechadv.2025.108716
Sie S, Zha Z, Li J, u. a.Verbesserung der katalytischen Leistung von XYL10C_∆N durch Loop-Engineering zur Nutzung von lignocellulosischer Biomasse in der Futter- und Brennstoffindustrie. Biotechnologie Biokraftstoffe. 2021;14(1):195. doi:10.1186/s13068-021-02044-3
Zhou X, Wang H, Zhang Y, Gao L, Feng Y. Änderung der Substratspezifitäten von thermophilen α/β-Hydrolasen durch Domänenaustausch und Optimierung der Domänenschnittstelle. ABBS. 2012;44(12):965-973. doi:10.1093/abbs/gms086

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Projektbeschreibung:

Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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