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Kern-Random-Mutagenese und DNA-Shuffling-Dienste

Anfrage

Bei Kreative Enzyme, unser Kernleistungen für zufällige Mutagenese und DNA-Shuffling bilden die zentrale Säule unseres Enzymtechnik Plattform. Wir sind auf die Generierung von hochdiversen Mutantenbibliotheken und das Umordnen homologer DNA-Fragmente spezialisiert, um die Entdeckung von Enzymen mit verbesserter Leistung zu beschleunigen. Mit einer integrierten Suite fortschrittlicher molekularbiologischer Werkzeuge entwerfen, konstruieren und bewerten wir Bibliotheken, die es Forschern ermöglichen, den Sequenzraum von Enzymen effizient zu erkunden und überlegene Biokatalysatoren zu identifizieren.

Unsere Dienstleistungen kombinieren Mutagenese-Expertise, rationales Screening-Designund Hochdurchsatzbewertungund stellt sicher, dass jeder Schritt – von der Variantencreation bis zur Aktivitätsvalidierung – wissenschaftlich rigoros und reproduzierbar ist. Egal, ob das Ziel darin besteht, die katalytische Aktivität zu erhöhen, die Substratspezifität zu verändern, die Thermostabilität zu verbessern oder die Lösungsmittelbeständigkeit zu erhöhen, Creative Enzymes bietet eine zuverlässige, kosteneffiziente und umfassende Lösung für die Enzym-Evolution.

Hintergrund: Zufällige Mutagenese und DNA-Shuffling für die Enzymtechnik

Zufällige Mutagenese und DNA-Shuffling sind Grundtechniken in gerichtete Enzym-Evolution, was die Schaffung von Sequenzvielfalt und die anschließende Auswahl verbesserter Varianten ermöglicht. Im Gegensatz zu rationalen Entwurfsansätzen, die auf vorherigem strukturellen oder mechanistischen Wissen basieren, führt die zufällige Mutagenese und Rekombination zu einer breiten Palette genetischer Variationen, die eine von der Natur inspirierte Erkundung funktionaler Landschaften ermöglichen.

Zufällige Mutagenese—erreicht durch Methoden wie fehleranfällige PCR, chemische Mutagenese oder Mutator-Stämme—führt Punktmutationen zufällig in einem Gen ein und ahmt den evolutionären Prozess der natürlichen Mutationsakkumulation nach. Im Gegensatz dazu, DNA-Mischung rekombiniert Fragmente homologer Gene, tauscht vorteilhafte Mutationen und Domänenarchitekturen zwischen Varianten aus, um chimäre Enzyme mit neuartigen Eigenschaften zu schaffen.

Die Kraft dieser Methoden liegt jedoch nicht nur in der Mutation selbst, sondern auch darin, wie die Bibliotheken werden konstruiert, verwaltet und gescreent. Schlecht gestaltete Bibliotheken, voreingenommene Mutationsverteilungen oder ineffiziente Screening-Methoden können vorteilhafte Varianten verschleiern oder falsch-negative Ergebnisse erzeugen. Daher ist ein gut koordiniertes Arbeitsablauf – von der Mutagenese bis zur funktionalen Bewertung – entscheidend für den Erfolg.

Bei Creative Enzymes kombinieren wir jahrzehntelange Expertise in der Enzymologie, computergestützte Analysen und molekularbiologische Präzision, um sicherzustellen, dass jede Bibliothek wissenschaftlich fundiert und experimentell zuverlässig ist. Unser integrierter Ansatz ermöglicht es Forschern, leistungsstarke Enzymvarianten schnell, reproduzierbar und in großem Maßstab zu identifizieren.

Core random mutagenesis and DNA shuffling services for enzyme engineering

Zufällige Mutagenese und DNA-Shuffling-Dienste: Dienstleistungen und Kapazitäten

Creative Enzymes bietet eine umfassende Palette von Kernleistungen, die darauf ausgelegt sind, jeden Aspekt des Aufbaus von Enzymlibraries und der funktionalen Screening zu unterstützen. Unser integrierter Arbeitsablauf gewährleistet eine präzise Kontrolle über die Mutationsgenerierung, die Diversität der Bibliothek und die nachgelagerte Bewertung.

Mutagenesebibliothekskonstruktion für die Enzymtechnik

Wir entwerfen und konstruieren vielfältige Mutantenbibliotheken, die auf Ihre experimentellen Ziele zugeschnitten sind. Dabei verwenden wir modernste Techniken wie fehleranfällige PCR, chemische Mutageneseund DNA-MischungWir erstellen umfangreiche Sammlungen von Enzymvarianten, die unterschiedliche Ebenen der Sequenzvielfalt repräsentieren.

Jede Bibliothek ist sorgfältig ausbalanciert, um eine wünschenswerte Mutationsrate zu erreichen – typischerweise 1–3 Mutationen pro Kilobase – und dabei ausreichend Vielfalt zu gewährleisten, ohne die Proteinfunktion zu beeinträchtigen. Wir bieten auch maßgeschneiderte kombinatorische Mutagenesedienste für gezielte Reste oder Regionen an, die hybride Strategien zwischen zufälligem und semi-rationalem Design ermöglichen.

Bibliotheken sind vollständig dokumentiert, sequenzverifiziert (wo anwendbar) und in Formaten geliefert, die für nachgelagerte Screening- oder Expressionstests bereit sind.

Entwicklung von Aktivitätsassay-Methoden zur Bewertung von Mutantenbibliotheken

Eine effektive Screening beginnt mit dem richtigen Test. Wir entwickeln maßgeschneiderte Aktivitätsassay-Methoden zur effizienten Bewertung großer Mutantenbibliotheken. Unsere Wissenschaftler entwerfen und validieren hochdurchsatzkompatible Assays, die auf dem katalytischen Mechanismus des Enzyms, der Substratspezifität und den Anforderungen an die Detektion basieren.

Wir bieten eine Vielzahl von Assay-Formaten an, darunter spektrophotometrische, fluorometrische, kolorimetrische und chromatographische Systeme sowie gekoppelte Enzym- und reporterbasierte Nachweisschemata. Für komplexe enzymatische Reaktionen können wir auch Assays für das Screening in 96- oder 384-Well-Platten miniaturisieren, um Geschwindigkeit, Reproduzierbarkeit und Kosteneffizienz zu gewährleisten.

Bibliotheks-Screening für verbesserte Enzymvarianten

Screening ist der entscheidende Schritt in der Enzym-Evolution – dort werden vorteilhafte Varianten entdeckt und validiert. Creative Enzymes bietet umfassende Screening-Lösungen für Enzymbibliotheken, die durch zufällige Mutagenese oder DNA-Shuffling erzeugt wurden.

Durch den Einsatz automatisierter oder halbautomatisierter Workflows bewerten wir Tausende von Varianten mittels Hochdurchsatz-Aktivitätstests, Thermostabilitätstests oder Substratumwandlungsanalysen. Zu unseren Dienstleistungen gehört auch die Datenanalyse und die Rangordnung von Kandidaten basierend auf der katalytischen Effizienz.kKatze/KM), Enantioselektivität, Stabilität und andere definierte Parameter.

Wir liefern detaillierte Screening-Berichte und können die nachgelagerte Charakterisierung vielversprechender Mutanten unterstützen, um einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung zur funktionalen Validierung zu gewährleisten.

Service-Workflow

Workflow of core enzyme engineering by random mutagenesis and DNA shuffling

Kunden können einzelne Dienstleistungen wählen oder von unserem umfassenden Paket profitieren.

Dienstmerkmale

Unterstützte Mutagenesemethoden

  • Fehleranfällige PCR: Kontrollierte Einführung von Mutationen durch verzerrte Polymerasebedingungen.
  • Chemische Mutagenese: Zufällige Nukleotidveränderung unter Verwendung mutagener Reagenzien.
  • DNA-Shuffling: Fragment-Rekombination homologer Sequenzen zur Erstellung hybrider Gene.
  • Standort-Sättigungs-Mutagenese: Fokussierte Untersuchung von Schlüsselresten zur Verbesserung katalytischer Eigenschaften.

Bibliotheksformate

  • Plasmid-DNA-Bibliotheken (für die Expression in Klienten-Wirten).
  • Transformierte Zellbibliotheken (E. coli, Pichiaoder Bacillus).
  • Glycerol-Stämme für die sofortige Screening.

Analysefähigkeiten

  • Colorimetrische und fluorometrische Enzymassays.
  • Kopplung oder substratspezifische Reaktionssysteme.
  • Bewertungen der thermischen und lösungsmittelbedingten Stabilität.
  • Enantioselektivität und Substratprofilierungsassays.

Screening-Durchsatz

  • Kleinmaßstab: 100–500 Klone.
  • Mittelmaß: 1.000–5.000 Klone.
  • Großangelegt: 10.000+ Klone (robotisch).

Liefergegenstände

  • Mutantenbibliothek (DNA, Plasmid oder Glycerolstock).
  • QC- und Mutationsvielfaltsbericht.
  • Assayprotokolle und Zusammenfassung der Screening-Daten.
  • Sequenzierungsergebnisse der ausgewählten Top-Varianten.

Ein Angebot einholen

Warum Sie sich für unsere Dienstleistungen entscheiden sollten

Umfassende Workflow-Integration

Wir bieten umfassende Dienstleistungen an – von der Mutagenese bis zum Screening – und gewährleisten Konsistenz und Reproduzierbarkeit während Ihres gesamten Projekts.

Expertise in der Enzym-Evolution

Unser Team vereint Molekularbiologen, Computerwissenschaftler und Enzymologen mit jahrzehntelanger Erfahrung in der Protein-Evolution.

Anpassbare und skalierbare Lösungen

Egal, ob Sie eine kleine gezielte Bibliothek oder großangelegte DNA-Mischung benötigen, unsere Dienstleistungen passen sich der Komplexität und dem Umfang Ihres Projekts an.

Erweiterte Screening-Fähigkeiten

Wir integrieren Hochdurchsatz-Screening-Technologien mit präziser analytischer Validierung für eine robuste Trefferidentifikation.

Datengetriebene Entscheidungsunterstützung

Unsere detaillierte Analyse hilft Ihnen, Mutationsmuster zu interpretieren und Struktur-Funktions-Beziehungen effektiv zu identifizieren.

Qualität, Zuverlässigkeit und Vertraulichkeit

Alle Arbeiten werden unter strengen Qualitätskontrollen und Vertraulichkeitsvereinbarungen durchgeführt, um Ihr geistiges Eigentum zu schützen.

Fallstudien und praktische Erkenntnisse

Fall 1: DNA-Shuffling-gesteuerte Verbesserung der HPPD-Herbizidresistenz bei Reis

Ein mesotrione-resistenter Mutant, MFRR-2, wurde aus einem Reis und Zea mays HPPD-DNA-Shuffling-Bibliothek. Trotz leicht reduzierter Stabilität wies MFRR-2 eine vergleichbare Aktivität wie das Wildtyp-OsHPPD bei 25 °C auf und behielt ~90 % Aktivität unter 50 μM Mesotrione, im Vergleich zu einem Rückgang um 50 % bei OsHPPD. Interessanterweise Fe2+ hemmte die Enzymaktivität. Transgene Reislinien, die MFRR-2 exprimieren, zeigten eine 1,5-fache höhere Mesotrionresistenz als OsHPPD-Transgenics. Diese Studie demonstriert die effektive Nutzung von DNA-Shuffling für die HPPD-gesteuerte Evolution und bietet eine vielversprechende Strategie zur Entwicklung von herbizidresistenten Pflanzen.

DNA shuffling–driven improvement of rice HPPD herbicide resistance Abbildung 1. Multiple Sequenzalignment von MFRR-2, OsHPPD und mutant-ZmHPPD. Die Zahlen über den Aminosäuresequenzen geben die Restpositionen von MFRR-2 an. Die konservierten Aminosäuren sind in einem roten Kästchen dargestellt. Die grüne und blaue Schattierung weist auf die möglichen Splicing-Segmente von Reis und Mais hin. (Chen u. a.., 2023)

Fall 2: Evolution der GH2-Familie β-Galactosidasen mittels degenerativer Oligonukleotid-Gen-Shuffling

Um die biochemischen Eigenschaften von GH2 β-Galactosidasen zu verbessern, wurden vier Alteromonas Gene wurden einer degenerierten Oligonukleotid-basierten Familienmischung unterzogen. Vierzehn überlappende Genabschnitte wurden rekombiniert und auf β-Galactosidase-Aktivität gescreent, was etwa 320 positive Klone ergab, von denen neun Chimären waren. Zwei Mutanten, M22 und M250, wurden exprimiert und charakterisiert. Beide behielten die optimale Temperatur und Substratspezifität der Wildtyp-Enzyme bei, während M22 eine verbesserte katalytische Effizienz aufwies und M250 eine schwache Transglycosylierungsaktivität zeigte. Diese Studie zeigt, dass kontrollierte Familienmischung effektiv funktionale chimäre Enzyme mit verbesserten Eigenschaften erzeugt, die für Labor- und industrielle Anwendungen geeignet sind.

Screening chimeric β-galactosidases generated by gene shufflingAbbildung 2. Die chimären β-Galaktosidasen nach dem Screening auf Enzymaktivität. (Sun u. a.., 2023)

Häufig gestellte Fragen: Zufällige Mutagenese und DNA-Shuffling

  • Q: Welche Arten von Enzymen sind für zufällige Mutagenese und DNA-Shuffling geeignet?

    Fast alle Enzymklassen können mit diesen Methoden entwickelt werden, einschließlich Hydrolasen, Oxidoreduktasen, Transferasen und Isomerasen.

  • F: Wie groß sollte meine Mutantenbibliothek für eine zuverlässige Entdeckung sein?

    Typische Bibliotheken reichen von 103 bis 105 Varianten, abhängig von der Enzymkomplexität und den Zielmutationsraten. Wir helfen dabei, Bibliotheken zu entwerfen, um Vielfalt und Handhabbarkeit auszubalancieren.

  • F: Kann ich mein eigenes Expressionsvektor oder Wirtsstamm bereitstellen?

    A: Ja. Wir können Ihr bevorzugtes Vektor- und Wirtsystem verwenden oder optimierte Optionen basierend auf den Eigenschaften Ihres Enzyms empfehlen.

  • Q: Wie stellen Sie eine gleichmäßige Verteilung von Mutationen bei der zufälligen Mutagenese sicher?

    A: Wir optimieren die Reaktionsbedingungen und verwenden validierte Polymerasen, um ausgewogene Nukleotidaustauschfrequenzen zu erreichen und Verzerrungen zu minimieren.

  • Q: Können Sie Hochdurchsatz-Screening in 384-Well-Formaten durchführen?

    A: Ja. Wir bieten miniaturisierte und automatisierte Testsysteme für die großflächige Variantenbewertung an.

  • F: Welche Daten erhalte ich nach dem Screening?

    A: Kunden erhalten umfassende Berichte, die die Bibliothekszusammensetzung, Assay-Protokolle, Varianten-Ranglisten, Sequenzierungsdaten und statistische Analysen umfassen.

  • F: Wie lange dauert ein typisches Projekt?

    A: Je nach Projektgröße dauern der Bau der Bibliothek und das erste Screening typischerweise 4–8 Wochen.

  • Q: Sind Vertraulichkeit und Datenbesitz garantiert?

    A: Absolut. Alle Kundeninformationen, Abläufe und Ergebnisse sind durch strenge Vertraulichkeitsvereinbarungen geschützt, und alle geistigen Eigentumsrechte verbleiben beim Kunden.

Referenzen:

  1. Chen L, Liu R, Tan Q, u. a.Verbesserung der Herbizidresistenz von Reis 4-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase durch DNA-Shuffling-basierten gerichteten Evolution. J Agrar- und Lebensmittelchemie2023;71(41):15186-15193. doi:10.1021/acs.jafc.3c04079
  2. Sun J, Wang W, Hao J. Evolution der GH2-Familie β-Galactosidasen mittels degenerativer Oligonukleotid-Gen-Shuffling. Biotechnologie Briefe. 2023;45(5-6):655-665. doi:10.1007/s10529-023-03368-w
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Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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