Strukturbasierte Mutagenese & Kombinatorisches Enzymdesign

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Kreative Enzyme stellt bereit Strukturbasierte Mutagenese und kombinatorische Enzymdesign-Dienste die fortschrittliche strukturelle Biologie, computergestütztes Modellieren und experimentelle Mutagenese nutzen, um Enzymfunktionen präzise neu zu programmieren. Durch die Integration hochauflösender struktureller Daten mit kombinatorischen Mutationsstrategien identifizieren und assemblieren wir rational vorteilhafte Mutationen, die die katalytische Leistung, Stabilität, Spezifität oder Toleranz unter industriellen Bedingungen verbessern. Unsere Plattform vereint molekulare Einsichten mit kombinatorischer Vielfalt und gewährleistet einen schnellen und effizienten Weg vom Designkonzept zur optimierten Enzymvariante. Ob für Forschung, pharmazeutische Synthese oder industrielle Biokatalyse, Creative Enzymes bietet präzise, datengestützte Lösungen im Enzymengineering.

Was ist strukturbasierte Mutagenese und kombinatorisches Enzymdesign?

Enzym Die Funktionalität ist tief verwurzelt in ihrer dreidimensionale Struktur—jedes Atom und jede Restgruppe trägt zur komplexen Choreografie der Katalyse bei. Das Verständnis und die Nutzung dieser Beziehung bilden die Grundlage des strukturbasierten Enzymdesigns.

Im Gegensatz zu zufällige Mutagenese oder rein empirische Methoden, strukturbasierte Mutagenese ermöglicht gezielte Modifikationen von Aminosäureresten, die durch kristallographische oder computergestützte Daten geleitet werden. Dieser Ansatz stellt sicher, dass jede Mutation mit einem klaren Ziel ausgewählt wird – sei es zur Stabilisierung einer flexiblen Schleife, zur Optimierung des Substratzugangs oder zur Umgestaltung der Geometrie des aktiven Zentrums für eine verbesserte Spezifität.

Um die Designmöglichkeiten über einzelne Mutationen hinaus zu erweitern, kombinatorisches Enzymdesign untersucht die synergistischen Effekte mehrerer Substitutionen. Durch die systematische Kombination von individuell vorteilhaften Mutationen werden optimierte Varianten mit additiven oder sogar synergistischen Leistungsverbesserungen aufgedeckt. In Kombination mit computergestützten Vorhersagen und Hochdurchsatz-Screening bietet dieser duale Ansatz beispiellose Kontrolle und Effizienz bei der Enzymoptimierung.

Simplified workflow diagram of combinatorial enzyme design Abbildung 1. Kombinatorische Assemblierung und Gestaltung von Enzymen. (Lipsh-Sokolik) u. a.., 2023)

Creative Enzymes kombiniert rationale Mutagenese, molekulare Modellierung und kombinatorische Assemblierung um hochgradig effiziente Enzymdesign-Workflows bereitzustellen. Unser Fachwissen umfasst verschiedene Enzymfamilien, von Hydrolasen und Oxidoreduktasen bis hin zu Transferasen und Lyasen, und dient Anwendungen in der Pharmaindustrie, der grünen Chemie, der Lebensmitteltechnologie und der Bioenergiebranche.

Strukturbasierte Mutagenese & Kombinatorisches Enzymdesign: Was wir anbieten

Creative Enzymes bietet ein umfassendes Angebot an strukturgeleiteter Mutagenese und kombinatorischen Entwurfsdiensten, die jede Phase der rationalen Enzymoptimierung abdecken:

Strukturanalyse und Zielidentifikation

Bewertung von Kristallstrukturen oder Homologiemodellen zur Identifizierung katalytischer Rückstände, flexibler Regionen und stabilitätsbestimmender Motive.
Erkennung von mutationsanfälligen Hotspots durch computergestütztes Scannen und Residueninteraktionsmapping.
Bewertung potenzieller Kompromisse zwischen Aktivität, Stabilität und Substratauswahl.

Strukturbasierte Mutagenese

Rationales Design von einzelnen oder mehreren Punktmutationen, die durch Struktur-Funktions-Beziehungen informiert sind.
Mutationen, die auf Wasserstoffbrücken, Salzbrücken, Flexibilität von Schleifen, hydrophobe Packung oder Cofaktorbindung abzielen.
Standortgerichtete und Sättigungsmutagenese-Strategien zur Erforschung präziser Aminosäureaustausche.

Kombinatorisches Enzymdesign

Systematische Kombination von vorteilhaften Einzelmutationen mithilfe von computergestützten Rekombinationsalgorithmen.
Bau von kombinatorischen Bibliotheken, die synergistische Effekte auf die Enzymleistung untersuchen.
Energiebewertung und Stabilitätsevaluation zur Identifizierung optimaler Variantenkombinationen vor der Synthese.

Computational Modeling und Simulation

Molekulare Docking- und Dynamik-Simulationen zur Vorhersage von Substratinteraktionen und konformationaler Flexibilität.
Berechnung von Energielandschaften, Lösungsmittelfekten und Stabilitätsbewertungen von Resten.
Strukturelle Visualisierung und Vorhersage der mutationalen Auswirkungen durch in silico Analysen.

Experimentelle Mutagenese und Validierung

Hochgenaue zielgerichtete Mutagenese und Konstruktion von kombinatorischen Bibliotheken.
Expression und Reinigung ausgewählter Varianten.
Biochemische und kinetische Tests zur Validierung von Aktivität, Stabilität und Enantioselektivität.

Integration mit nachgelagerten Anwendungen

Übertragung optimierter Enzymvarianten für industrielle, pharmazeutische oder biosynthetische Anwendungen.
Optionale nachgelagerte Dienstleistungen, einschließlich Aktivitätsmessung, mechanistischer Studien und struktureller Charakterisierung.

Service-Workflow

Service workflow for structure-based mutagenesis and combinatorial enzyme design

Projektoutputs

Servicemodul	Liefergegenstände
Strukturanalyse und Modellierung	3D-Modell, Rückstandszuordnung, Bericht über mutationsreiche Hotspots
Rationale Mutagenese-Design	Mutationsvorschlagsliste, strukturelle Begründung
Kombinatorisches Bibliotheksdesign	Variantenkombinationen, vorhergesagte Energiewerte
Molekulare Dynamik & Docking-Simulation	Energielandschaft, konformationale Analyse
Experimentelle Mutagenese und Expression	Verifizierte mutante Klone, gereinigtes Enzym
Enzymatische Charakterisierung	Kinetische Daten, Stabilitätsprofile, Aktivitätsvergleich
Umfassender Abschlussbericht	Umfassende Analyse, experimentelle Validierung, zukünftige Orientierung

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Unsere herausragenden Vorteile

Integrierte rechnergestützte und experimentelle Expertise

Wir kombinieren rechnergestütztes Enzymdesign mit experimenteller Mutagenese und gewährleisten so einen vollständig validierten rationalen Ingenieurprozess.

Präzise strukturelle Einsicht

Unsere Methoden basieren auf der strukturellen Biologie und energiegestützten Modellierung und bieten ein atomares Verständnis der Enzymfunktion.

Effiziente kombinatorische Strategie

Anstatt Tausende von zufälligen Mutanten zu screenen, entwerfen wir intelligent begrenzte, aber hochwahrscheinliche Kombinationen für maximale Leistungssteigerungen.

Interdisziplinäres Team

Unser Team aus Biochemikern, Strukturbiologen und Computerwissenschaftlern stellt sicher, dass jedes Design biologisch relevant und experimentell umsetzbar ist.

Anpassbare und skalierbare Lösungen

Von Einzelpunktverbesserungen bis hin zu großflächigen kombinatorischen Optimierungen sind unsere Dienstleistungen auf die technischen und industriellen Bedürfnisse jedes Kunden zugeschnitten.

Qualitätssicherung und Vertraulichkeit

Jedes Projekt wird unter strengen Qualitätskontrollen durchgeführt und durch Vertraulichkeitsvereinbarungen geschützt, um sowohl Genauigkeit als auch Datensicherheit zu gewährleisten.

Fallstudien und reale Beispiele

Fall 1: Hochaktive Enzyme durch automatisierte kombinatorische Rückgratassemblierung und Sequenzdesign

Diese Studie stellt eine automatisierte Methode für das Enzymdesign vor, die auf der kombinatorischen Rückgratmontage basiert. Diese Methode erstellt neue Enzymrückgrate aus homologen, aber unterschiedlichen Strukturen und optimiert sie mit Rosetta, während die katalytischen Reste erhalten bleiben. Angewendet auf zwei TIM-Fass-Enzymfamilien—GH10 Xylanasen und PLL Lactonasen—erzeugte der Ansatz jeweils 43 und 34 Designs, wobei 21 GH10- und 7 PLL-Enzyme Aktivität zeigten, einschließlich einiger von Vorlagen mit <25% Sequenzidentität. Vier Designs entsprachen der natürlichen Enzymaktivität, und die Kristallographie bestätigte die atomare Genauigkeit. Durch die strategische Segmentierung von β-α-Rückgrat-Einheiten und das Testen mehrerer Segmentierungsschemata zeigte die Methode Flexibilität und Potenzial zur Schaffung stabiler, aktiver und vielfältiger Enzyme.

Machine learning-guided co-optimization approach for designing diverse combinatorial enzyme libraries Abbildung 2. Verschiedene Segmentierungsschemata, die in der kombinatorischen Backbone-Assemblierung verwendet werden. a GH10(I): Jedes der acht β-α-Einheiten wurde unabhängig ausgewählt, um maximale Backbone-Diversität zu erreichen. b GH10(II): Segmentierung der β-α-Einheiten 1, 2-4, 5-6 und 7-8, um stabilisierende Wechselwirkungen innerhalb jedes Segments zu bewahren. c GH10(III): eine diskontinuierliche Segmentierung, bei der die strukturell konservierten β-α-Einheiten 1 und 5-6 ein Segment bildeten und zwei andere Segmente durch die Einheiten 2-4 und 7-8 gebildet wurden. d Die Homodimer-Oberfläche in PLLs (β-α-Einheiten 1-3 und 8, grau) wurde als ein Backbone-Segment verwendet, und die Einheiten 4-7 wurden unabhängig ausgewählt. (Ding u. a.., 2024)

Fall 2: Kombinatorische Assemblierung und Design von Enzymen

Diese Arbeit präsentiert CADENZ (Kombinatorische Assemblierung und Design von ENZymen), eine maschinelles Lernen und atomistische Methode, die Enzymfragmente entwirft, die in der Lage sind, vielfältige, stabile und katalytisch kompetente Strukturen zu bilden. Bei der Anwendung auf Endoxylanasen erzeugte CADENZ Tausende von aktiven und strukturell variierenden Enzymen. Durch die Verwendung von Golden Gate Assembly, Hefedisplay und aktivitätsbasierten Sonden identifizierten die Forscher aktive Designs, von denen 58 % die Substratumwandlung katalysierten. Langzeit-Sequenzierung offenbarte 3.114 unterschiedliche Designs über 756 Rückgrate hinweg – weit über die natürliche Vielfalt hinaus – mit bis zu 169 Mutationen und 48–73 % Sequenzidentität zu natürlichen Homologen. Die Einbeziehung von Erkenntnissen über Packung und Vororganisation verbesserte den Erfolg um das Zehnfache und ergab über 10.000 aktive Enzyme.

CADENZ machine-learning and atomistic design platform generating diverse, active engineered enzymes Abbildung 3. CADENZ erzeugt funktionale Enzyme mit hoher Struktur- und Sequenzvielfalt. (A) (oben) repräsentative Modellstrukturen der von CADENZ entwickelten Enzyme. Bereiche, die zwischen den vier Designs variieren, sind farblich hervorgehoben. (unten) Die elektrostatistischen Potentialoberflächen des aktiven Zentrums der repräsentativen Designs zeigen markante Unterschiede (vermutete ligandgebundene Konformation in gelben Stäbchen basierend auf dem PDB-Eintrag 4PUD). (B) Verteilung der Sequenzidentität zu den nächstgelegenen natürlichen Homologen aktiver Rückgratstrukturen. (C) Die Anzahl der einzigartigen Strukturen, aus denen Fragmente entnommen werden. Die meisten aktiven Designs integrieren Fragmente aus vier verschiedenen Quellen. (Lipsh-Sokolik) u. a.., 2023)

Häufig gestellte Fragen

Die Hauptunterschiede zwischen strukturbasierter Mutagenese und zufällige Mutagenese?

A: Strukturbasierte Mutagenese ist ein rationaler Ansatz, der von 3D-Strukturen von Enzymen und computergestützter Analyse geleitet wird und sich auf spezifische Rückstände konzentriert, die für die Funktion entscheidend sind. Im Gegensatz dazu beruht die zufällige Mutagenese auf stochastischen Mutationen und Screening ohne vorheriges Wissen über Struktur oder Mechanismus.
Q: Welche Art von strukturellen Informationen wird benötigt, um ein Projekt zu starten?

A: Wir können mit experimentell bestimmten Kristallstrukturen, Kryo-EM-Daten oder rechnerisch vorhergesagten Modellen (wie AlphaFold2) arbeiten. Wenn keine Struktur verfügbar ist, kann unser Team Homologiemodellierung durchführen, um eine zu erstellen.
Q: Können Sie rechnerische und experimentelle Arbeiten in einem Projekt kombinieren?

A: Ja. Creative Enzymes bietet einen integrierten Workflow, bei dem computergestützte Modellierung direkt die experimentelle Mutagenese informiert und so eine kohärente Durchführung von Design bis Validierung gewährleistet.
F: Wie groß sind die kombinatorischen Bibliotheken, die Sie typischerweise erstellen?

A: Wir entwerfen fokussierte kombinatorische Bibliotheken (von Dutzenden bis zu Hunderten von Varianten), um ein effizientes Screening zu gewährleisten und gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, überlegene Enzyme zu identifizieren.
F: Welche Arten von Enzymeigenschaften können durch diesen Service verbessert werden?

Unsere strukturbasierten und kombinatorischen Designansätze können die katalytische Effizienz, Substratspezifität, Enantioselektivität, Lösungsmittelbeständigkeit und Thermostabilität unter anderem verbessern.
F: Wie lange dauert ein typisches Projekt?

A: Je nach Komplexität des Projekts dauert ein vollständiger Design-Validierungszyklus in der Regel 6–10 Wochen, einschließlich computergestützter Analyse, Mutagenese, Expression und Charakterisierung.
Bieten Sie eine nachgelagerte Charakterisierung von entworfenen Enzymen an?

A: Ja. Wir bieten Aktivitätsassays, kinetische Parameterbestimmungen und strukturelle Validierungen an, um die verbesserte Leistung des entworfenen Enzyms vollständig zu bestätigen.

Referenzen:

Ding K, Chin M, Zhao Y, u. a.Maschinenlernen-gesteuerte Co-Optimierung von Fitness und Diversität erleichtert das Design kombinatorischer Bibliotheken in der Enzymtechnik. Nat Commun2024;15(1):6392. doi:10.1038/s41467-024-50698-y
Lipsh-Sokolik R, Khersonsky O, Schröder SP, u. a.Kombinatorische Assemblierung und Gestaltung von Enzymen. Wissenschaft. 2023;379(6628):195-201. doi:10.1126/science.ade9434

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Projektbeschreibung:

Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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