Hochdurchsatz-Screening und Aktivitätsprofilierung von entworfenen Enzymbibliotheken

Anfrage

Kreative Enzyme stellt bereit Hochdurchsatz-Screening und Aktivitätsprofilierung von entworfenen Enzymbibliotheken Dienstleistungen die Leistung rational entworfener Enzyme zu bewerten und zu optimieren. Diese Dienstleistungen überbrücken die Lücke zwischen computational design und praktische Anwendung, die transformiert in silico Vorhersagen in messbare katalytische Ergebnisse umsetzen.

Durch den Einsatz fortschrittlicher Hochdurchsatz-Screening-Plattformen, präziser Aktivitätsassays und detaillierter kinetischer Analysen identifizieren wir Enzymvarianten, die überlegene Eigenschaften wie erhöhte Aktivität, Selektivität oder Stabilität aufweisen. Unser integrierter Ansatz stellt sicher, dass jedes rational entworfene Enzym einer strengen funktionalen Validierung und quantitativen Bewertung unterzogen wird, bevor eine nachgelagerte Optimierung oder Skalierung erfolgt.

Durch die Kombination von strukturellem Wissen, biochemischer Expertise und modernster Instrumentierung bietet Creative Enzymes einen zuverlässigen und effizienten Weg, um rationale Enzymdesigns in bewährte Biokatalysatoren zu verwandeln.

Warum Hochdurchsatz-Screening und Aktivitätsprofilierung wichtig sind

Rationale Enzymdesign ermöglicht gezielte Modifikationen von Proteinstrukturen, um eine verbesserte katalytische Effizienz, veränderte Substratspezifität oder erhöhte Umweltresilienz zu erreichen. Allerdings sind computergestützte Vorhersagen allein nicht ausreichend – experimentelle Bestätigungen sind unerlässlich, um sicherzustellen, dass theoretische Verbesserungen in funktionale Leistungen umgesetzt werden.

Hochdurchsatz-Screening und Aktivitätsprofilierung spielen eine entscheidende Rolle bei der Überprüfung des Erfolgs des rationalen Designs. Durch aktivitätsbasierte Assays, bindende Analysen, und kinetische ProfilierungForscher können die vielversprechendsten Enzymvarianten identifizieren und die mechanistischen Auswirkungen der eingeführten Mutationen verstehen.

Hochdurchsatz-Screening ermöglicht die schnelle Bewertung einer großen Anzahl von entworfenen Varianten unter Verwendung verschiedener analytischer Plattformen wie spektrophotometrischen, fluorometrischen und chromatographischen Assays. Sobald leistungsstarke Kandidaten identifiziert sind, können Aktivitätsprofilierung und kinetische Charakterisierung verwendet werden, um ihre katalytischen Parameter zu quantifizieren.K_M, k_Katzeund k_Katze/K_M), um ein mechanistisches Verständnis dafür zu vermitteln, wie strukturelle Modifikationen die Enzymfunktion beeinflussen.

Creative Enzymes integriert beide Phasen – Hochdurchsatz-Funktionsscreening und detaillierte Aktivitäts- und kinetische Profilierung – in eine einzige, nahtlose Dienstleistungsplattform. Unser interdisziplinäres Team vereint Fachwissen in Enzymologie, struktureller Biologie und computergestütztem Design und stellt sicher, dass jedes rational entwickelte Enzym mit wissenschaftlicher Präzision und industrieller Relevanz gründlich bewertet wird.

Molecular docking results of the native active site (NAS) of E1 and engineered active site (EAS) of EE Abbildung 1. Natürlicher aktiver Bereich (NAS) und ingenieurer aktiver Bereich (EAS) (Anpassung von Krishna) u. a., 2024)

Was wir anbieten: Hochdurchsatz-Screening und Aktivitätsprofilierung

Creative Enzymes bietet umfassende Dienstleistungen, die den gesamten Prozess der funktionalen Validierung für rational entworfene Enzyme abdecken:

Funktionales Screening von entworfenen Varianten

Entwicklung maßgeschneiderter, hochdurchsatzfähiger Assays zur Erkennung enzymatischer Aktivität in Variantenbibliotheken.
Screening unter mehreren Bedingungen (pH, Temperatur, Substratkonzentration), um die Leistungsoptima zu identifizieren.
Bewertung des Substratspektrums und der Reaktionsselektivität.

Hochdurchsatz-Assay-Entwicklung

Entwurf und Optimierung von kolorimetrischen, fluorometrischen oder gekoppelten Enzymassays.
Miniaturisierung von Reaktionen für 96-, 384- oder 1536-Well-Formate.
Integration automatisierter Flüssigkeitshandhabungssysteme für effizienten Durchsatz.

Kinetische Charakterisierung

Bestimmung der Schlüssel-Katalysatorparameter: K_M, V_max, k_Katze, und k_Katze/K_M.
Michaelis-Menten- und Lineweaver-Burk-Analysen für Reaktionskinetik.
Bewertung der katalytischen Effizienz über verschiedene Substrate und Cofaktoren hinweg.

Thermodynamische und Stabilitätstests

Bewertung der thermischen Denaturierung (Tm), Halbwertszeit (t_1/2), und Restaktivität.
pH- und Lösungsmittelverträglichkeitsassays zur Optimierung industrieller Enzyme.
Stabilitätsprofilierung unter prozessrelevanten Bedingungen.

Substratbindung und Spezifitätsanalyse

Bestimmung der Bindungsaffinitäten mittels Oberflächenplasmonresonanz (SPR) oder isothermer Titrationskalorimetrie (ITC).
Analyse der Substratdiskriminierung und Produktverteilung.

Mechanistische Einblicke und Datenberichterstattung

Korrelation von kinetischen Ergebnissen mit strukturellen und computergestützten Modellen.
Umfassende Datenanalyse mit grafischen Darstellungen von kinetischen Kurven und Parameteranpassung.
Technische Berichterstattung und optionale Empfehlungen zur weiteren Optimierung.

Service-Workflow

Workflow diagram for high-throughput screening and activity profiling of rationally designed enzymes

Dienstleistungen Ergebnisse

Servicemodul	Liefergegenstände
Assay-Entwicklung	Angepasster Aktivitätsassay, Validierungsdaten
Hochdurchsatz-Screening	Aktivitätsprofile für alle Varianten
Kinetische Charakterisierung	K_M, k_Katze, k_Katze/K_M Daten, kinetische Kurven
Stabilitätsbewertung	Thermische/pH-Stabilitätsdaten
Substratspezifitätsanalyse	Bindungs- und Aktivitätsdaten für mehrere Substrate
Abschlussbericht	Vollständiger technischer Bericht mit Interpretation

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Warum Sie mit uns zusammenarbeiten sollten

Integrierte rechnergestützte und experimentelle Expertise

Wir kombinieren rationales Enzymdesign mit präziser experimenteller Validierung, um eine nahtlose Kontinuität von der Theorie zur Funktion zu gewährleisten.

Anpassbare Screening- und Assay-Entwicklung

Unsere hauseigenen Enzymologie-Spezialisten passen jede Analyse an den einzigartigen katalytischen Mechanismus und die industrielle Anwendung Ihres Enzyms an.

Umfassende kinetische Bewertung

Detaillierte kinetische Profilierung bietet ein quantitatives Verständnis des katalytischen Verhaltens und unterstützt fundierte Entscheidungen für weitere Ingenieurtätigkeiten.

Hochdurchsatz-Screening-Kapazität

Durch den Einsatz automatisierter Plattformen screenen wir Tausende von Enzymvarianten schnell, verkürzen die Projektzeitpläne und gewährleisten gleichzeitig die Genauigkeit.

Robuste Dateninterpretation und mechanistische Einblicke

Jedes Projekt umfasst die Korrelation von kinetischen Daten mit der Enzymstruktur und computergestützten Vorhersagen, die tiefere funktionale Einblicke bieten.

Vertraute Qualität und Vertraulichkeit

Wir halten strenge Vertraulichkeitsvereinbarungen ein und halten uns an strenge Qualitätsstandards, um Zuverlässigkeit und Datenintegrität zu gewährleisten.

Erfolgsgeschichten

Fall 1: Screening von rational entworfenem Hydrolase-Varianten zur Verbesserung der Aktivität

Kundenbedarf:

Ein Unternehmen für industrielle Biokatalyse strebte an, die Effizienz einer Hydrolase zu verbessern, die für die Spaltung von Esterbindungen in der Feinchemiesynthese verwendet wird. Das native Enzym zeigte eine moderate Aktivität, jedoch eine geringe Umsetzungsrate bei voluminösen Substraten, was seine kommerzielle Viabilität für breitere Substratklassen einschränkte.

Unser Ansatz:

Wir haben rechnergestützte rationale Designmethoden angewendet, um eine Bibliothek von Hydrolase-Varianten zu erzeugen, die auf Rückstände in der Nähe des katalytischen Trios abzielt, um den Übergangszustand zu stabilisieren und die Substratunterbringung zu verbessern. Mithilfe eines miniaturisierten fluorometrischen Screening-Assays haben wir die katalytische Umwandlung schnell über Hunderte von Varianten hinweg bewertet. Strukturelles Modellieren und Rosetta-basierte Energiescores wurden integriert, um Designs mit vorhergesagten niedrigeren Aktivierungsbarrieren und erhöhter Bindungsflexibilität zu priorisieren.

Ergebnis:

Eine leistungsstarke Variante wurde identifiziert, die eine 3,5-fache Steigerung der katalytischen Effizienz aufwies.k_Katze/K_M) und die Toleranz gegenüber größeren Ester-Substraten erheblich verbessert. Die Ergebnisse bestätigten unsere Entwurfshypothese einer verbesserten Stabilisierung des Übergangszustands und lieferten einen soliden Kandidaten für die Prozessoptimierung in industriellen Syntheseabläufen.

Fall 2: Kinetische Charakterisierung einer thermostabilen Oxidoreduktase

Kundenbedarf:

Ein Biotechnologie-Kunde, der thermostabile Enzyme für die Biofuel-Produktion entwickelt, benötigte eine Oxidoreduktase, die in der Lage ist, bei erhöhten Prozesstemperaturen eine hohe katalytische Aktivität aufrechtzuerhalten. Das Wildtyp-Enzym denaturierte schnell über 60 °C, was die Ausbeute und Stabilität unter Bioreaktorbedingungen verringerte.

Unser Ansatz:

Durch strukturgeleitete rationale Gestaltung haben wir spezifische Mutationen entwickelt, die voraussichtlich den hydrophoben Kern des Enzyms verstärken und die Wasserstoffbrückenbindungen in kritischen Schleifenbereichen verbessern. Nach Expression und Reinigung wurden die Variante und der Wildtyp einer detaillierten kinetischen und thermodynamischen Charakterisierung über einen Temperaturbereich von 25–85 °C unterzogen. Differenzielle Scanning-Fluorimetrie (DSF) und stationäre Kinetik wurden verwendet, um die Thermostabilität und katalytischen Parameter zu quantifizieren.

Ergebnis:

Die entwickelte Oxidoreduktase zeigte einen Anstieg der Schmelztemperatur (Tm) um 9°C und eine doppelt so hohe katalytische Effizienz bei 65°C im Vergleich zum Wildtyp. Diese Verbesserungen bestätigten eine erfolgreiche strukturelle Stabilisierung und ermöglichten eine konsistente Enzymleistung in der Bioprozessierung bei hohen Temperaturen, was dem Kunden half, die Enzymbeladung und die Gesamtherstellungskosten zu senken.

Häufig gestellte Fragen

Q: Welche Arten von Enzymen können gescreent und charakterisiert werden?

Wir können alle wichtigen Enzymklassen – Hydrolasen, Oxidoreduktasen, Transferasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen – mithilfe maßgeschneiderter Aktivitätsassays bewerten, die für jeden Mechanismus geeignet sind.
F: Wie viele Enzymvarianten können in einem einzigen Projekt gescreent werden?

A: Unsere Hochdurchsatzsysteme können je nach Komplexität des Assays und den Anforderungen an das Substrat effizient Hunderte bis Tausende von Varianten analysieren.
Q: Können Sie einen maßgeschneiderten Test für ein neuartiges oder proprietäres Enzym entwerfen?

A: Ja. Unsere Enzymologen können vollständig maßgeschneiderte Nachweissysteme entwickeln – kolorimetrisch, fluorometrisch oder chromatographisch – die auf den Reaktionstyp Ihres Enzyms abgestimmt sind.
Q: Welche kinetischen Parameter bieten Sie an?

A: Wir berichten K_M, k_Katze, V_max, und k_Katze/K_Mneben Temperatur, pH-Profilen und detaillierter kinetischer Kurvenanpassung für Michaelis-Menten oder alternative Modelle.
Q: Wie stellen Sie die Reproduzierbarkeit von Ergebnissen sicher?

A: Alle Tests werden mit mehreren Wiederholungen unter streng kontrollierten Bedingungen durchgeführt, wobei statistische Validierung und Fehleranalyse in den Abschlussberichten enthalten sind.
Q: Können Sie diese Ergebnisse in weitere Schritte der Enzymtechnik integrieren?

A: Absolut. Funktionale und kinetische Daten können direkt leiten gerichtete Mutagenese, Schleifenoptimierungoder gerichtete Evolution für die nächste Stufe der Verbesserung.
Welche Informationen benötigen Sie, um das Projekt zu starten?

A: Wir benötigen typischerweise die Enzymsequenz, das Strukturmodell oder die PDB-Datei (sofern verfügbar) sowie alle bekannten Aktivitäts- oder Assay-Daten. Unser Team wird dann einen detaillierten Versuchsplan entwerfen.
F: Wie ist der erwartete Projektzeitplan?

A: Je nach Komplexität des Projekts und der Anzahl der Varianten benötigt der vollständige Workflow in der Regel 6–10 Wochen von der Assay-Einrichtung bis zur endgültigen Berichterstattung.

Referenz:

Krishna NB, Roopa L, Pravin Kumar R, S GT. Computergestützte Studien zum katalytischen Potenzial der doppelten aktiven Stelle für die Enzymtechnik. Wissenschaftliche Berichte2024;14(1):17892. doi:10.1038/s41598-024-60824-x

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Dienstleistungen & Produkte von Interessierten

Projektbeschreibung:

Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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