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Professionelle und kostensparende Lösungen

Kartierung aktiver Stellen

Die präzise Charakterisierung des aktiven Zentrums eines Enzyms ist entscheidend für das Verständnis seines katalytischen Mechanismus, seiner Substratspezifität und seines Potenzials für das Enzyme Engineering. Bei Creative Enzymes liefert unser Service zur Active-Site-Kartierung (Active Site Mapping) umfassende Einblicke in die molekulare Architektur, Schlüsselreste und die funktionelle Dynamik enzymatischer aktiver Zentren. Durch die Kombination fortschrittlicher experimenteller und computergestützter Verfahren ermöglichen wir unseren Auftraggebern, kritische Aminosäurereste zu identifizieren, Bindungstaschen zu definieren und das rationale Design von Inhibitoren, Substraten oder maßgeschneiderten Enzymvarianten zu steuern.

Warum das aktive Zentrum eines Enzyms untersucht werden sollte

Enzymatische aktive Zentren sind die zentralen Bereiche, in denen Substrate binden und Reaktionen ablaufen. Kenntnisse über die Architektur des aktiven Zentrums und funktionelle Reste sind essenziell, um Reaktionsmechanismen aufzuklären, die Substratkompatibilität vorherzusagen und zielgerichtete Modulatoren zu entwickeln. Klassische Methoden wie Mutagenese und kinetische Assays bieten – in Kombination mit modernen spektroskopischen und computergestützten Ansätzen – eine bislang unerreichte Auflösung zur Identifizierung kritischer Wechselwirkungen im aktiven Zentrum. Active Site Mapping dient damit als grundlegendes Werkzeug in der Biokatalyse, Wirkstoffforschung und Protein-/Enzymentwicklung.

Enzyme active site and its role in drug discoveryAbbildung 1. Distale Stellen, die für Enzymfunktionen wichtig sind. A, distale Hotspots gekoppelt an das aktive Zentrum. B, funktionelle Mutationen distal von den TEM-1-Aktivzentren. (Yu et al., 2022)

Unsere Serviceleistungen

Service-Workflow

Workflow of enzyme active site mapping service

Service-Details

Creative Enzymes bietet einen umfassenden und flexibel anpassbaren Service zur Active-Site-Kartierung, der experimentelle, computergestützte und analytische Ansätze umfasst:

Service Details
Experimentelle Charakterisierung
  • Gerichtete Mutagenese (Site-Directed Mutagenesis): Systematischer Austausch von Aminosäuren zur Bestimmung ihres Beitrags zu Katalyse und Substratbindung.
  • Kinetisches Profiling: Messung von Aktivitätsänderungen bei Wildtyp- und Mutantenenzymen zur Identifikation funktioneller Reste.
  • Chemisches Labeling & Footprinting: Einsatz kovalenter Sonden oder reaktiver Substrate zur Identifizierung zugänglicher Reste innerhalb des aktiven Zentrums.
  • Spektroskopische Verfahren: UV/Vis-, Fluoreszenz-, CD- oder NMR-basierte Detektion von Konformationsänderungen und Interaktionen am aktiven Zentrum.
  • Inhibitor-Bindungsstudien: Evaluierung bekannter oder kundenspezifisch entwickelter Inhibitoren zur Validierung funktioneller Bereiche.
Computergestützte Kartierung
  • Molekulares Docking: Simulation der Substrat- und Inhibitorbindung zur Identifizierung von Schlüsselresten und Interaktions-Hotspots.
  • Molekulardynamik-Simulationen: Analyse der Enzymflexibilität, Substratorientierung und dynamischer Interaktionen innerhalb des aktiven Zentrums.
  • Strukturmodellierung & Visualisierung: Hochauflösende dreidimensionale Kartierung des aktiven Zentrums zur intuitiven Interpretation und als Grundlage für Designentscheidungen.
Integrierte Analyse & Reporting
  • Umfassende Korrelation experimenteller und computergestützter Ergebnisse.
  • Identifizierung katalytischer Reste, Substratbindetaschen und essenzieller Strukturmotive.
  • Visuelle und quantitative Darstellung von Active-Site-Merkmalen für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Enzyme Engineering oder Wirkstoffforschung.

Kontaktieren Sie unser Team

Vorteile unserer Services

Expertise

Jahrzehntelange Erfahrung in Enzymologie, Strukturbiologie und computergestützter Modellierung.

Umfassender Ansatz

Die Integration experimenteller und computergestützter Methodik gewährleistet eine robuste und verlässliche Kartierung.

Individualisierung

Projekte werden auf Enzymtyp, Zielsetzung des Auftraggebers und gewünschte Auflösung zugeschnitten.

Modernste Technologie

Einsatz hochmoderner Instrumentierung, High-Performance-Computing und fortschrittlicher Softwaretools.

Umsetzbare Erkenntnisse

Die Ergebnisse liefern klare Entscheidungsgrundlagen für Enzyme Engineering, Inhibitor-Design und Substratoptimierung.

Vertraulichkeit & Compliance

Strikte Einhaltung von Datensicherheits- und regulatorischen Anforderungen.

Repräsentative Fallstudien

Fall 1: Active-Site-Kartierung einer humanen Protein-Tyrosin-Phosphatase für die Wirkstoffforschung

Herausforderung des Auftraggebers:

Ein Pharmaunternehmen entwickelt selektive Inhibitoren für PTPs, die an Krebserkrankungen beteiligt sind. Der Leitwirkstoff des Auftraggebers hemmte jedoch mehrere Phosphatasen und führte dadurch zu Off-Target-Effekten. Ohne präzise Kenntnis des aktiven Zentrums war eine Optimierung der Selektivität schwierig.

Lösung:

Wir führten eine Active-Site-Kartierung durch, basierend auf einer Kombination aus kovalenten Sonden, gerichteter Mutagenese und molekularem Docking. Dadurch konnten kritische Reste identifiziert werden, die zur Substratbindung und Katalyse beitragen. Die Kartierung zeigte zudem subtile strukturelle Unterschiede zwischen homologen PTPs, die für ein selektives Inhibitor-Design genutzt werden können.

Ergebnis:

  • Identifikation von drei Schlüsselresten, die die Substratspezifität bestimmen.
  • Unterstützung der Synthese eines neuen Inhibitors mit 5-fach verbesserter Selektivität für die Ziel-PTP gegenüber eng verwandten Isoformen.
  • Ermöglichte eine fokussiertere Lead-Optimierung und reduzierte potenzielle Off-Target-Toxizität.

Fall 2: Kartierung der Akzeptorstelle einer bakteriellen Glykosyltransferase

Herausforderung des Auftraggebers:

Ein Biotech-Unternehmen entwickelt einen enzymatischen Glykosylierungsprozess für niedermolekulare Verbindungen mit pharmazeutischer Zielanwendung. Die bakterielle Glykosyltransferase zeigte eine promiskuitive Aktivität gegenüber mehreren Akzeptorsubstraten und erzeugte heterogene Produkte. Für die Optimierung der Regioselektivität war ein detailliertes Verständnis der Akzeptor-bindenden Reste erforderlich.

Lösung:

Wir setzten gerichtete Mutagenese in Kombination mit molekularem Docking und kinetischer Analyse ein, um Reste innerhalb der Akzeptor-Bindetasche systematisch zu untersuchen. Dadurch wurden „Gatekeeper“-Reste identifiziert, die Substratorientierung und Spezifität steuern. Mutanten wurden in Enzymassays getestet, um die vorhergesagten Effekte zu bestätigen.

Ergebnis:

  • Entwickelte Varianten erzeugten Einzel-Regioisomer-Produkte mit >90 % Ausbeute.
  • Reduzierung unerwünschter Nebenreaktionen und damit verbesserte nachgelagerte Aufreinigung.
  • Strukturelle Erkenntnisse als Grundlage für das rationale Design von Glykosyltransferase-Varianten der nächsten Generation für pharmazeutische Anwendungen.

FAQs

  • F: Welche Enzyme können mit Ihrem Active-Site-Mapping-Service analysiert werden?

    A: Wir können ein breites Spektrum an Enzymen analysieren, einschließlich Hydrolasen, Oxidoreduktasen, Transferasen, Lyasen und Ligasen – sowohl natürliche als auch gentechnisch/enzymtechnisch optimierte Varianten.
  • F: Wie lange dauert Active Site Mapping typischerweise?

    A: Der Zeitplan variiert je nach Enzymkomplexität und Projektumfang und liegt typischerweise zwischen 6 und 10 Wochen. Für dringende Projekte sind beschleunigte Services verfügbar.
  • F: Sind gereinigte Enzyme erforderlich?

    A: Ja, bevorzugt werden gereinigte Enzyme mit bestätigter Aktivität. Bei Bedarf können wir auch eine Enzymreinigung als Service anbieten.
  • F: Können Ihre Ergebnisse das Design von Wirkstoffen oder Inhibitoren unterstützen?

    A: Ja. Die Identifizierung funktioneller Reste und Bindungstaschen ermöglicht ein rationales Inhibitor-Design sowie eine strukturgeleitete Wirkstoffentwicklung.
  • F: Welche Deliverables sind enthalten?

    A: Auftraggeber erhalten einen detaillierten Bericht, 3D-Visualisierungen der aktiven Zentren, Rohdaten und aufbereitete experimentelle Daten, computergestützte Modelle sowie umsetzbare Empfehlungen.
  • F: Bieten Sie eine Nachberatung an?

    A: Ja, unser Team unterstützt bei der Interpretation der Ergebnisse, der Planung nachfolgender Experimente sowie der Umsetzung der Erkenntnisse in Enzyme Engineering oder therapeutische Entwicklung.

Literatur:

  1. Hong SH, Xi SY, Johns AC, et al. Mapping the chemical space of active‐site targeted covalent ligands for protein tyrosine phosphatases. ChemBioChem. 2023;24(10):e202200706. doi:10.1002/cbic.202200706
  2. Variot C, Capule D, Arolli X, et al. Mapping roles of active site residues in the acceptor site of the PA3944 Gcn5‐related N ‐acetyltransferase enzyme. Protein Science. 2023;32(8):e4725. doi:10.1002/pro.4725
  3. Yu H, Ma S, Li Y, Dalby PA. Hot spots-making directed evolution easier. Biotechnology Advances. 2022;56:107926. doi:10.1016/j.biotechadv.2022.107926

Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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