KI-gestützte Optimierung von Expression und Löslichkeit

Anfrage

Creative Enzymes setzt Machine Learning und Sequenz-Engineering ein, um die Ausbeute der heterologen Expression, den löslichen Anteil und die Sekretionseffizienz zu maximieren. Unsere Plattform identifiziert und behebt Codon-Bias, Fehlfaltungsneigung, aggregationsanfällige Regionen sowie Wirt-Inkompatibilitäten bereits vor der Konstruktsynthese und reduziert dadurch Zeit- und Kostenaufwand vom Gen bis zum gereinigten Protein.

Expressionsengpässe

Die heterologe Expression liefert häufig nicht genügend funktionelles Enzym für Forschungs- oder Produktionsmaßstab. Zu den typischen Engpässen zählen:

Codon-Bias-Fehlanpassung

Seltene Codons im Zielgen verursachen Translationspausen, Frameshifts oder vorzeitige Termination im Produktionswirt.

Aggregationsanfällige Regionen

Hydrophobe Abschnitte oder amyloidogene Sequenzen fördern die Bildung von Inclusion Bodies oder irreversible Oligomerisierung.

Geringe lösliche Ausbeute

Geringer Anteil korrekt gefalteten Proteins im Verhältnis zur Gesamtmenge des exprimierten Materials, was die Reinigungskosten erhöht.

Ineffiziente Sekretion

Suboptimale Signalpeptide, Translokationsbarrieren oder Zurückweisung durch die Faltungs-Qualitätskontrolle begrenzen die extrazelluläre Akkumulation.

Wirtstoxizität

Enzymaktivität oder Expressionslast beeinträchtigen die Viabilität des Wirts und reduzieren die Biomasseausbeute.

Diese Engpässe sind häufig anhand von Sequenzmerkmalen und wirtsspezifischen Restriktionen vorhersagbar und ermöglichen proaktives Engineering statt reaktiver Fehlersuche.

KI-gestützte Sequenzoptimierung

Unsere Plattform adressiert vier sequenzbasierte Determinanten der Expressionsleistung:

Codon-Nutzung

Wirtsadaptierte Codon-Optimierung im Gleichgewicht zwischen Translationsgeschwindigkeit, mRNA-Stabilität und tRNA-Verfügbarkeit. Modelle berücksichtigen lokale Codon-Kontexteffekte und vermeiden extreme Verschiebungen des GC-Gehalts.

Aggregationsregionen

Vorhersage und Auflösung hydrophober Patches, β-Faltblatt-anfälliger Segmente sowie ladungskomplementärer Grenzflächen, die während oder nach der Faltung Selbstassoziation fördern.

Löslichkeitsvorhersage

Sequenzbasierte Bewertung der intrinsischen Löslichkeit mit Identifikation N-terminaler, C-terminaler und interner Segmente, die sich für die Fusion von Löslichkeitstags oder für mutationale „Softening“-Ansätze eignen.

Optimierung von Signalpeptiden

In-silico-Screening natürlicher und designter Signalsequenzen hinsichtlich Translokationseffizienz, Genauigkeit der Signalpeptidase-Spaltung und Kompatibilität mit der Faltungskinetik des Zielproteins.

Jedes Optimierungsziel wird durch prädiktive Modelle adressiert, die auf gepaarten Sequenz-Expressions-Datensätzen über mehrere Wirtsysteme hinweg trainiert wurden.

Analyse der Wirt-Kompatibilität

Der Expressionserfolg hängt von der Passung zwischen Proteineigenschaften und Wirtskapazitäten ab. Unsere Analyse bewertet:

Protease-Empfindlichkeit

Identifikation von Spaltstellen für Wirtsproteasen und Empfehlung protektiver Mutationen oder protease-defizienter Wirtsstämme

Chaperon-Bedarf

Bewertung der Faltungskomplexität im Verhältnis zur Chaperon-Kapazität des Wirts, inklusive Vorschlägen für Koexpressionsstrategien oder Host-Engineering

Anforderungen an Disulfidbrücken

Erkennung nicht-nativer Disulfidbildung in reduzierenden zytoplasmatischen Umgebungen und Empfehlung oxidativer Faltungswirte oder Cystein-Substitutionen

Bedarf an posttranslationalen Modifikationen

Kennzeichnung von Anforderungen an Glykosylierung, Phosphorylierung oder andere Modifikationen, die die Wirtsauswahl bestimmen oder die Entfernung von Modifikationsstellen erforderlich machen können

Das Wirt-Kompatibilitäts-Scoring unterstützt die Stammauswahl und Empfehlungen zu Prozessparametern vor der experimentellen Prüfung.

Workflow

Workflow zur KI-gestützten Optimierung von Expression & Löslichkeit

1. Sequenzanalyse: Das Zielgen wird im vorgesehenen Wirt auf Codon-Bias, Aggregationsneigung, Löslichkeits-Score und Signalpeptid-Effizienz analysiert. Baseline-Expressionsrisiken werden nach dem prognostizierten Einfluss auf die Ausbeute priorisiert.

2. Konstrukt-Design: KI-Modelle schlagen optimierte codierende Sequenzen mit angepasster Codon-Nutzung, aufgelösten Aggregationsregionen und optionalen Löslichkeitstag-Fusionen vor. Für Sekretionsziele werden Signalpeptide ausgewählt oder konstruiert.

3. Wirtsauswahl: Die Kompatibilitätsanalyse empfiehlt das optimale Expressionssystem basierend auf Faltungsanforderungen, Modifikationsbedarf und Skalierbarkeitsrestriktionen.

4. Bibliothekskonstruktion: Optimierte Konstrukte werden synthetisiert und sequenzverifiziert. Kleine Variantenbibliotheken können erzeugt werden, um alternative Signalpeptide oder Positionierungen von Löslichkeitstags zu evaluieren.

5. Expressions-Screening: Konstrukte werden in den empfohlenen Wirt transformiert und hinsichtlich Gesamtausbeute, löslichem Anteil, monomerer Reinheit und biologischer Aktivität bewertet. Sekretierte Produkte werden im Kulturmedium quantifiziert.

6. Iterative Verfeinerung: Expressionsdaten schärfen die Codon-Optimierungsmodelle und Prädiktoren der Wirt-Kompatibilität. Unterperformende Konstrukte werden diagnostiziert und bei Bedarf in einem zweiten Zyklus neu designt.

Unterstützung bei der Wet-Lab-Validierung

Sequenzoptimierung muss durch messbare Expressionsergebnisse validiert werden. Unsere Pipeline bietet eine umfassende Charakterisierung:

Leistung	Beschreibung
Ausbeutequantifizierung	Gesamt- und lösliche Proteinausbeute mittels Densitometrie, ELISA oder Aktivitätsassay, normalisiert auf Biomasse oder Kulturvolumen
Löslichkeitsprofiling	Fraktionierung in lösliche und unlösliche Anteile mit analytischer Bewertung der Inclusion-Body-Morphologie und des Refolding-Potenzials
Monomere Reinheit	Größenausschlusschromatographie und native PAGE zur Bestätigung des Oligomerzustands und der Abwesenheit von Aggregaten
Sekretionseffizienz	Quantifizierung des extrazellulären gegenüber dem intrazellulären Produkt, inklusive Verifizierung der Signalpeptid-Spaltung durch N-terminale Sequenzierung
Aktivitätsbestätigung	Funktioneller Assay des löslichen oder sekretierten Materials, um sicherzustellen, dass Sequenzmodifikationen die katalytische Kompetenz nicht beeinträchtigt haben
Scale-up-Bewertung	Vorläufige Bewertung der Expressionskonsistenz bei erhöhten Kulturvolumina zur Identifikation von Risiken beim Prozesstransfer

Validierungsergebnisse unterstützen die Rangfolge der Konstrukte und steuern die nachgelagerte Reinigung sowie die Prozessentwicklung.

Fallstudie

Machine-Learning-Optimierung der Enzymlöslichkeit und -aktivität

Abbildung 1. Durch ein Machine-Learning-Modell unterstützte Optimierung der Proteinlöslichkeit. (Han et al., 2020)

In dieser Studie wurde eine Machine-Learning-basierte Optimierungsstrategie entwickelt, um die Enzymlöslichkeit und die katalytische Leistungsfähigkeit durch das Design kurzer Peptid-Tags zu verbessern. Mithilfe eines Support-Vector-Regression-Modells, das auf Proteinsequenz- und Löslichkeitsdaten trainiert wurde, wendeten die Forschenden einen iterativen Optimierungsalgorithmus an, um Peptid-Tags zu evolvieren, die eine erhöhte Proteinlöslichkeit prognostizieren ließen. Die experimentelle Validierung zeigte, dass getaggte Enzyme eine signifikant verbesserte Löslichkeit und Aktivität aufwiesen. Insbesondere zeigte die Tyrosin-Ammoniak-Lyase eine mehr als zweifache Steigerung der Löslichkeit sowie eine Aktivitätssteigerung um 250 %, während zwei weitere Enzyme ebenfalls eine erhöhte Löslichkeit zeigten. Die Arbeit demonstriert, wie computergestützte Optimierung unter Verwendung der Löslichkeit als Surrogatparameter für Proteinaktivität das Enzym-Engineering für Anwendungen in Metabolic Engineering und Biotechnologie beschleunigen kann.

FAQs

F: Welche Wirte unterstützen Sie?

A: E. coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Säugerzellen (CHO, HEK293) sowie Baculovirus-Insektenzell-Systeme.
F: Können Sie sowohl Sekretion als auch intrazelluläre Expression optimieren?

A: Ja. Signalpeptid-Auswahl, Translokationsoptimierung und Engineering der Faltungs-Qualitätskontrolle sind integrierte Bestandteile unserer sekretionsfokussierten Designs.
F: Garantieren Sie eine bestimmte Ausbeutesteigerung?

A: Wir garantieren die stringente Durchführung des Optimierungsworkflows mit quantitativer Berichterstattung. Konkrete Ausbeuteziele werden als Projektmeilensteine definiert.
F: Können expressionsoptimierte Varianten anschließend hinsichtlich Aktivität oder Stabilität weiterentwickelt werden?

A: Ja. Expressionsoptimierte Gerüste dienen als robuste Ausgangspunkte für nachfolgendes katalytisches oder Stabilitäts-Engineering oder können mittels Multi-Objective-Scoring ko-optimiert werden.
F: Wie ist der typische Zeitplan?

A: 6–10 Wochen pro Design-Test-Zyklus. Die meisten Projekte erreichen die Ziel-Expression innerhalb von 2 Zyklen.
F: Stellen Sie gereinigtes Protein bereit?

A: Ja. Gereinigtes Material kann als Zusatzleistung für validierte Varianten geliefert werden.

References:

Han X, Ning W, Ma X, Wang X, Zhou K. Improving protein solubility and activity by introducing small peptide tags designed with machine learning models. Metabolic Engineering Communications. 2020;11:e00138. doi:10.1016/j.mec.2020.e00138

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Projektbeschreibung:

Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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