KI-gestützte Optimierung von Aktivität und Spezifität

Anfrage

Creative Enzymes setzt computergestütztes Active-Site-Engineering ein, um den katalytischen Umsatz zu steigern, die Substratselektivität zu schärfen und das Reaktionsspektrum bestehender Enzyme zu erweitern. Durch die Modellierung der präzisen Geometrie und der elektronischen Umgebung des katalytischen Zentrums identifizieren wir Mutationen, die Bindungsaffinität, Stabilisierung des Übergangszustands und die Kinetik der Produktfreisetzung direkt modulieren.

Herausforderungen bei der katalytischen Optimierung

Die Verbesserung der katalytischen Leistungsfähigkeit erfordert Eingriffe auf mechanistischer Ebene. Typische Herausforderungen sind:

Unzureichender Umsatz

Katalytische Raten unterhalb prozessrelevanter Schwellenwerte infolge suboptimaler Übergangszustandsstabilisierung oder langsamer Produktfreisetzung.

Breite Spezifität

Promiskuitives Substratspektrum beeinträchtigt die Produktreinheit und erschwert die nachgelagerte Aufreinigung/Trennung.

Geringe Enantioselektivität

Unzureichende Unterscheidung zwischen Stereoisomeren in Anwendungen der chiralen Synthese.

Cofaktor-Fehlanpassung

Präferenz für teure oder instabile Cofaktoren statt praktikabler Alternativen, z. B. NADH versus NADPH.

Inhibitor-Empfindlichkeit

Produkt- oder Substratinhibition begrenzt die operativ einsetzbaren Substratkonzentrationen.

Diese Herausforderungen haben ihren Ursprung in der Architektur des aktiven Zentrums: Residuenpositionen, die die Substrattasche auskleiden, katalytische Dyaden oder Triaden sowie dynamische Schleifen, die den Substratzugang und den Produktaustritt steuern.

KI-gestützte Analyse des aktiven Zentrums

Unsere Plattform verknüpft Struktur und katalytische Funktion über drei integrierte Analysen:

Charakterisierung der Bindungstasche

Abbildung von Volumen, Form und physikochemischen Eigenschaften der Substratkavität zur Identifikation sterischer und elektronischer Restriktionen, die die Substraterkennung bestimmen.

Modellierung des Übergangszustands

Quantenmechanische und empirische Bewertung der Bindung von Übergangszustandsanaloga zur Quantifizierung des Potenzials katalytischer Effizienz und zur Identifikation stabilisierender Wechselwirkungen.

Analyse dynamischer Gatekeeper-Strukturen

Molekulardynamik-Simulationen von Schleifenregionen, die Substrateintritt und Produktfreisetzung kontrollieren, zur Identifikation konformationeller Engpässe, die den Umsatz limitieren.

Diese Analysen generieren Hypothesen auf Residuenebene zur Modulation von Aktivität und Spezifität und unterscheiden Positionen mit direktem Substratkontakt von solchen, die die Dynamik des aktiven Zentrums indirekt beeinflussen.

Workflow zur Priorisierung von Mutationen

Vorhergesagte Modifikationen im aktiven Zentrum werden über eine systematische Filter-Pipeline priorisiert:

Workflow zur Priorisierung von Mutationen

1. Identifikation funktioneller Hotspots: Koevolutionsanalyse und Metriken zur dynamischen Flexibilität markieren Positionen mit hoher Wahrscheinlichkeit für katalytische Relevanz.

2. Sättigungsmutagenese in silico: Jeder Hotspot wird rechnergestützt in alle 19 Alternativen mutiert. Scoring-Funktionen bewerten Bindungsenergie, Übergangszustandsstabilisierung und sterische Kompatibilität.

3. Design kombinatorischer Bibliotheken: Synergistische Mutationen werden mittels Epistasie-Modellierung identifiziert. Bibliotheksgrößen werden an die experimentelle Screening-Kapazität angepasst und maximieren zugleich die Abdeckung prognostiziert vorteilhafter Kombinationen.

4. Ausbalancierung multipler Eigenschaften: Aktivitätssteigernde Mutationen werden gegen Stabilitäts- und Expressionsprädiktoren gegengeprüft, um Trade-offs zu vermeiden, die die Prozessrobustheit und -tauglichkeit beeinträchtigen.

Unterstützung bei der Wet-Lab-Validierung

Computergestützte Vorhersagen sind ohne experimentelle Bestätigung nicht belastbar. Unsere Validierungspipeline stellt eine zuverlässige Überführung vom Modell in messbare Verbesserungen sicher:

Leistung	Beschreibung	Preis
Expression und Aufreinigung	Rekombinante Herstellung der am höchsten priorisierten Varianten in geeigneten Wirtsystemen mit standardisierten Aufreinigungsprotokollen	Anfrage
Kinetische Charakterisierung	Bestimmung von kcat, KM und kcat/KM unter definierten Assay-Bedingungen, die dem vorgesehenen Anwendungskontext entsprechen
Profilierung des Substratspektrums	Screening gegen Zielsubstrate und nahe Analoga zur Bestätigung von Spezifitätsverschiebungen oder -erweiterungen
Mechanistische Verifizierung	pH-Raten-Profile, Lösungsmittel-Kinetik-Isotopeneffekte und Inhibitor-Bindungsassays zur Bestätigung der prognostizierten mechanistischen Veränderungen

Die Ergebnisse fließen direkt in nachfolgende Design-Iterationen ein und schließen damit den Optimierungskreislauf.

Anwendungen

Prozessbiokatalyse

Beschleunigung der Umsatzraten für Reaktionen im Produktionsmaßstab und Reduktion der Katalysatorbeladung

Chirale Synthese

Engineering enantioselektiver Hydrolasen, Transferasen und Lyasen für die Herstellung pharmazeutischer Zwischenprodukte

Erweiterung des Substratspektrums

Anpassung etablierter Enzyme an nicht-natürliche Substrate für Anwendungen in der synthetischen Chemie

Cofaktor-Switching

Änderung der Cofaktor-Spezifität zur Anpassung an verfügbare Regenerationssysteme oder zur Senkung der Reagenzienkosten

Anti-Inhibitions-Engineering

Reduktion der Produktinhibition zur Ermöglichung höherer Substratkonzentrationen und volumetrischer Produktivität

Fallstudien

Machine-Learning-gestützte Steigerung der Proteinrobustheit

Machine learning enables selection of epistatic enzyme mutants for stability against unfolding and detrimental aggregation Abbildung 1. Machine Learning ermöglicht die Auswahl epistatischer Enzymmutanten mit Stabilität gegenüber Entfaltung und schädlicher Aggregation. (Li et al., 2021)

In dieser Studie wurde Machine Learning eingesetzt, um die Proteinrobustheit zu verbessern, wobei Limonen-Epoxid-Hydrolase als Modellenzym diente. Die Forschenden nutzten die innov'SAR-Plattform, die digitale Signalverarbeitung und Fourier-Transformations-(FT-)Analyse integriert, um Sequenzordnung, nichtlineare Residueninteraktionen und epistatische Effekte zu erfassen, die von konventionellen ML- und Deep-Learning-Ansätzen häufig übersehen werden. Die Methode sagte erfolgreich Mutationen voraus, die die Resistenz gegen Entfaltung und Aggregation erhöhten, und führte zu stabileren Enzymvarianten. In Kombination mit Molekulardynamik-Simulationen zeigte die Studie zudem mechanistische Zusammenhänge zwischen epistatischen Mutationsinteraktionen und Proteinstabilität auf. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial fortgeschrittener KI-gestützter Ansätze für rationales Protein-Engineering und die Entwicklung hochrobuster Biokatalysatoren.

Machine-Learning-Vorhersage der Spezifität von Glykosyltransferasen

Machine learning approach for predicting donor class Abbildung 2. Machine-Learning-(ML-)Ansatz zur Vorhersage der Donorklasse. (Taujale et al., 2020)

Diese Studie untersuchte die Evolution und funktionelle Diversität von Glykosyltransferasen (GTs) durch die Analyse von über 500.000 GT-A-Fold-Sequenzen. Die Forschenden identifizierten einen konservierten katalytischen Kern, der über diverse GT-Familien hinweg geteilt wird, während Variationen im Kern und hypervariable Schleifen zur funktionellen Diversifizierung beitrugen. Die phylogenetische Analyse zeigte, dass sich katalytische Mechanismen mehrfach unabhängig voneinander entwickelt haben. Auf Basis evolutions- und sequenzabgeleiteter Merkmale entwickelte das Team ein Machine-Learning-Framework zur Vorhersage der Donorzucker-Spezifität. Ein Gradient-Boosted-Regression-Tree-Modell, trainiert auf 713 charakterisierten GT-A-Sequenzen, erreichte eine Vorhersagegenauigkeit von etwa 90 % sowie 92 % Genauigkeit auf unabhängigen Validierungsdatensätzen. Der Ansatz bietet ein leistungsfähiges Framework für die funktionelle Annotation wenig untersuchter GTs sowie für das Verständnis von GT-Evolution, -Struktur und -Spezifität.

FAQs

F: Benötige ich eine Kristallstruktur, um zu beginnen?

A: Nein. Homologiemodelle mit ausreichender Qualität für die Active-Site-Analyse werden routinemäßig aus verwandten Strukturen generiert. Experimentelle Strukturen beschleunigen den Prozess, sind jedoch nicht zwingend erforderlich.
F: Wie viele Varianten werden typischerweise gescreent?

A: 20–50 Varianten für fokussierte Modifikationen im aktiven Zentrum; 100–200 für umfassendere Spezifitäts-Redesigns unter Einbezug mehrerer Taschenpositionen.
F: Können Sie die Aktivität verbessern, ohne die Stabilität zu beeinträchtigen?

A: Ja. Multi-Objective-Scoring bestraft destabilisierende Mutationen explizit. Stabilitätsprädiktoren werden bereits in der Filterstufe angewendet und nicht erst nachgelagert berücksichtigt.
F: Wie ist der typische Zeitplan?

A: 6–10 Wochen pro Design-Test-Zyklus. Die meisten Projekte erreichen die Zielperformance innerhalb von 2–3 Zyklen.
F: Wie gehen Sie mit Enzymen mit unbekanntem Mechanismus um?

A: Eine mechanistische Annotation erfolgt als vorbereitender Schritt anhand von Sequenz- und Strukturhomologie zu charakterisierten Verwandten. Unsicherheiten werden explizit quantifiziert und transparent kommuniziert.
F: Lässt sich dies mit Stabilitäts- oder Expressionsoptimierung integrieren?

A: Ja. Aktivitätsoptimierte Varianten können direkt in parallele Stabilitäts- oder Expressions-Workstreams überführt oder über Multi-Property-Scoring simultan optimiert werden.

References:

Li G, Qin Y, Fontaine NT, et al. Machine learning enables selection of epistatic enzyme mutants for stability against unfolding and detrimental aggregation. ChemBioChem. 2021;22(5):904-914. doi:10.1002/cbic.202000612
Taujale R, Venkat A, Huang LC, et al. Deep evolutionary analysis reveals the design principles of fold A glycosyltransferases. eLife. 2020;9:e54532. doi:10.7554/eLife.54532

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Projektbeschreibung:

Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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