Messung der Enzymaktivität der Homoserin-Dehydrogenase mittels spektrophotometrischer Assays

Creative Enzymes zählt zu den wenigen Unternehmen weltweit, die spektrophotometrische Assays für Homoserin-Dehydrogenase anbieten. Der komplexe katalytische Mechanismus verhindert bei den meisten Anbietern eine präzise Messung und Charakterisierung von Homoserin-Dehydrogenasen. Mit einem starken Team aus Enzymologen ist Creative Enzymes in der Lage, die enzymatische Aktivität der Homoserin-Dehydrogenase präzise und schnell zu bestimmen. Die Qualität unserer Ergebnisse wird durch modernste spektrophotometrische Instrumentierung sichergestellt.

Eine Homoserin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.3, HSD oder HSDH) ist ein Enzym, das die Oxidation von L‑Homoserin katalysiert und dabei NAD oder NADP als Redox-Kofaktor nutzt, um L‑Aspartat‑4‑Semialdehyd zu bilden. Das Enzym gehört zur Familie der Oxidoreduktasen. Es katalysiert zudem die Rückreaktion, bei der Homoserin als Produkt entsteht; das Gleichgewicht wird thermodynamisch bestimmt. Das Enzym ist an zahlreichen biologischen Stoffwechselwegen beteiligt:

• Glycin-, Serin- und Threonin-Stoffwechsel
• Cystein- und Methionin-Stoffwechsel
• Lysin-Biosynthese
• Biosynthese sekundärer Metabolite
• Mikrobieller Stoffwechsel in unterschiedlichen Umgebungen
• Biosynthese von Antibiotika

Der Aspartat-Stoffwechselweg ist sowohl an der Speicherung von Asparagin als auch an der Synthese der Aminosäuren der Aspartat-Familie beteiligt und dient daher der Speicherung und Nutzung von Stickstoff und Kohlenstoff. In diesem Stoffwechselweg katalysiert die Homoserin-Dehydrogenase den dritten Schritt, bei dem Aspartat‑β‑Semialdehyd zu Homoserin reduziert wird, einem essenziellen Zwischenprodukt in der Biosynthese von Threonin, Isoleucin und Methionin. In photosynthetischen Organismen akkumuliert Aspartat tagsüber und wird zur Synthese weiterer Aminosäuren genutzt. Nachts wird Aspartat zur Speicherung in Asparagin umgewandelt. In Säugetieren fehlt dieses Enzym. Daher müssen Säugetiere Threonin, Methionin und Isoleucin über externe Quellen aufnehmen, da diese essenziellen Aminosäuren über die Homoserin-Dehydrogenase synthetisiert werden.

Obwohl bereits Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Grundlagen der katalytischen Aktivität durchgeführt wurden, ist der exakte Mechanismus der vollständigen Homoserin-Dehydrogenase-Katalyse weiterhin nicht abschließend geklärt. Es wird angenommen, dass die Reaktion über einen Bi‑Bi-kinetischen Mechanismus abläuft, bei dem zunächst der NAD- bzw. NADP‑Kofaktor an das Enzym bindet, gefolgt von Substratbindung und Produktfreisetzung. Der Kofaktor dissoziiert anschließend am Ende der Reaktion vom Enzym. Insbesondere zeigt die Homoserin-Dehydrogenase bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen Kinetiken verschiedener Ordnung. Obwohl sowohl NAD als auch NADP als Redox-Kofaktor eingesetzt werden können, kann eine spezifische Homoserin-Dehydrogenase eine Präferenz für einen der beiden Kofaktoren aufweisen. Diese Komplexitäten erschweren die Aktivitätsbestimmung von Homoserin-Dehydrogenasen. Nach jahrelangen Tests und Optimierungen hat Creative Enzymes auf Basis eines fundierten Verständnisses von Struktur und Eigenschaften geeignete Aktivitätsassays für dieses Enzym entwickelt. Damit liefert unser Service die zuverlässigsten Assay-Ergebnisse.

Aufgrund der wichtigen biologischen Rolle der Homoserin-Dehydrogenasen und der Tatsache, dass sie in Säugetieren nicht vorkommen, hat sich dieses Enzym als wertvoll für ernährungswissenschaftliche, veterinärmedizinische und landwirtschaftliche Anwendungen erwiesen. Die Aktivitätsprüfung ist jedoch so anspruchsvoll, dass bislang selbst kein Aktivitäts-Assay-Kit am Markt verfügbar ist. Um Kunden bei der Lösung dieses Problems zu unterstützen, bietet Creative Enzymes spektrophotometrische Assays zur präzisen Bestimmung der enzymatischen Aktivität an – ein kritischer Parameter für die Entwicklung von Produkten mit Homoserin-Dehydrogenasen.

Abbildung: Das aktive Zentrum der Homoserin-Dehydrogenase aus Saccharomyces cerevisiae, mit Darstellung des Substrats Homoserin (magenta, Kugel) und des Kofaktors NAD (hellblau). PDB: 1EBU
Referenz: Stierand, K., & Rarey, M. (2010). ACS Medicinal Chemistry Letters, 1(9), 540–545. http://doi.org/10.1021/ml100164p