Aktivitätsassay-Design zur Bewertung von Mutantenbibliotheken

Anfrage

Bei Kreative Enzyme, unser Aktivitätsassay-Design zur Bewertung von Mutantenbibliotheken Der Service überbrückt die Lücke zwischen dem Bau von Mutantenbibliotheken und der funktionalen Entdeckung. Wir sind auf die Entwicklung präziser, empfindlicher und hochdurchsatzfähiger Assaysysteme spezialisiert, die die Enzymleistung unter relevanten Bedingungen genau widerspiegeln. Ob es um die Messung der katalytischen Umwandlung, der Substratumwandlung oder der Produktbildung geht, wir stellen sicher, dass jeder Assay robust, skalierbar und reproduzierbar ist.

Unser Team integriert biochemische Erkenntnisse mit fortschrittlichen Detektionstechnologien, um Prüfplattformen zu liefern, die für Mutantenbibliotheken optimiert sind – und bietet das wesentliche analytische Framework zur Identifizierung überlegener Enzymvarianten mit verbesserten Eigenschaften.

Hintergrund: Entwicklung rationaler Assays für die Enzymtechnik

Nach dem Aufbau einer vielfältigen Enzymmutantenbibliothek besteht die nächste Herausforderung darin, die Enzymaktivität effizient und zuverlässig bewertenDas Assay-Design bestimmt nicht nur, wie schnell Varianten gescreent werden können, sondern auch, wie genau funktionale Verbesserungen erkannt werden können. Schlecht optimierte Assays können vielversprechende Varianten verschleiern oder inkonsistente Daten liefern, was die Projekte zur Enzym-Evolution erheblich verlangsamen kann.

Um dies anzugehen, bietet Creative Enzymes einen spezialisierten Service an, der sich auf rationale Prüfungsentwicklungund stellen sicher, dass die Assay-Formate biochemisch relevant, technisch machbar und mit Hochdurchsatzplattformen kompatibel sind. Wir passen jedes Assay an den katalytischen Mechanismus des Enzyms, das Substratprofil und die gewünschten Eigenschaften (Aktivität, Selektivität, Stabilität oder Spezifität) an und schaffen so eine effektive Brücke von der Mutagenese zur Entdeckung.

Mutant selection by fluorescent-activated cell sorting Abbildung 1. Zufällige Mutagenese und Hochdurchsatz-Selektion von Mutanten unter Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellseparation (FACS) und Screening von Weghemmern. (Trovão u. a.., 2022)

Was wir anbieten

Wir bieten ein umfassendes Spektrum an Dienstleistungen zur Assay-Entwicklung und -Optimierung, die für Enzyme aller Klassen geeignet sind. Unsere Hauptangebote umfassen:

Assay-KonzeptdesignAuswahl des optimalen Assay-Formats (spektrophotometrisch, fluorometrisch, kolorimetrisch, chromatographisch oder gekoppelte Assays) basierend auf den Enzymmerkmalen und Zielreaktionen.
Substrat- und BedingungsoptimierungIdentifizierung der idealen Substratkonzentrationen, Cofaktorlevels, Puffersysteme sowie Temperatur-/pH-Bedingungen für eine genaue Aktivitätsmessung.
Entwicklung von NachweismethodenIntegration von sensitiven und quantitativen Detektionssystemen, einschließlich UV/Vis-Absorbanz, Fluoreszenz, Lumineszenz oder HPLC/LC–MS-Analytik.
Anpassung von Hochdurchsatz-AssaysMiniaturisierung und Automatisierung von Assays in 96-, 384- oder 1536-Well-Plattenformaten für ein effizientes Screening von Mutantenbibliotheken.
Validierung und BenchmarkingBewertung des Signal-Rausch-Verhältnisses, der Linearität, der Reproduzierbarkeit und des dynamischen Bereichs zur Sicherstellung der Zuverlässigkeit des Tests.
Benutzerdefinierte TestkitsOptionale Lieferung von gebrauchsfertigen Assay-Reagenzien oder Kits für Kunden, die interne Screenings durchführen.
DatenanalyseunterstützungAnleitung zur Daten-Normalisierung, Hintergrundsubtraktion und Leistungsstatistiken zur Gewährleistung einer rigorosen Interpretation.

Service-Workflow

Service workflow for designing activity assay methods for mutant library evaluation

Dienstmerkmale

Parameter	Beschreibung
Analysearten	Colorimetrisch, fluorometrisch, luminiszierend, spektrophotometrisch, chromatographisch oder gekoppelte Reaktionen
Durchsatzkapazität	Bis zu 10⁴–10⁵ Proben/Tag (automatisierte Systeme)
Instrumentenkompatibilität	Mikroplattenleser, Spektrophotometer, Fluorometer und LC–MS
Anpassungsgrad	Vollständig auf den zu bewertenden Enzymtyp und die Eigenschaften abgestimmt
Durchlaufzeit	3–5 Wochen, abhängig von der Komplexität
Liefergegenstände	Optimiertes Prüfprotokoll, Validierungsbericht und (optional) Prüfmittelkit

Ein Angebot einholen

Warum uns wählen

Mechanistische Expertise

Ein tiefes Verständnis der enzymatischen Mechanismen gewährleistet physiologisch und kinetisch relevante Assay-Designs.

Umfassende Erkennungsoptionen

Die Beherrschung mehrerer analytischer Plattformen ermöglicht eine genaue Messung verschiedener Enzymaktivitäten.

Hochdurchsatzbereitschaft

Alle Tests sind für skalierbare und automatisierte Screening-Anwendungen konzipiert.

Quantitative Präzision

Tests, die auf Reproduzierbarkeit, Linearität und Sensitivität validiert sind, um robuste Daten sicherzustellen.

Nahtlose Integration

Entwickelte Assays sind vollständig kompatibel mit unseren Mutantenbibliotheken und Screening-Systemen.

Kundenorientierte Anpassung

Flexible Testformate, die auf Ihr Enzym, Ihre Ziel-Eigenschaften und Ihre Durchsatzanforderungen zugeschnitten sind.

Vertretende Fallstudien

Fall 1: Entwicklung eines kolorimetrischen Assays zur Screening von Esterase-Bibliotheken

Kundenbedarf:

Eine Forschungsgruppe benötigte eine schnelle, hochdurchsatzfähige Methode, um eine große Bibliothek von Esterase-Mutanten auf erhöhte katalytische Aktivität gegenüber einem neuartigen Ester-Substrat zu bewerten. Bestehende HPLC-basierte Tests waren für die Analyse im Bibliotheksmaßstab zu zeitaufwendig.

Unser Ansatz:

Wir haben einen kolorimetrischen Assay entwickelt, der die Esterhydrolyse mit der Freisetzung von Chromophoren koppelt und eine Echtzeitüberwachung der Produktbildung über die Absorption bei 410 nm ermöglicht. Die Reaktionsbedingungen wurden für die Signallinearität optimiert, und die Methode wurde auf ein 384-Well-Format miniaturisiert.

Ergebnis:

Der Test reduzierte die Analysezeit pro Probe von Stunden auf Minuten und zeigte eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit (CV < 5%). Der Kunde identifizierte mehrere Esterase-Mutanten mit über 5-fach erhöhter Aktivität, was einen schnellen Übergang zur nachgelagerten kinetischen Charakterisierung ermöglichte.

Fall 2: Fluorometrische Analyse zur Bewertung von Dehydrogenase-Varianten

Kundenbedarf:

Ein Pharmaunternehmen benötigte eine empfindliche Methode zur Bewertung von NADH-abhängigen Dehydrogenase-Varianten zur Verbesserung der katalytischen Effizienz. Das Ziel war es, subtile Aktivitätsunterschiede unter Tausenden von Mutanten zu erkennen.

Unser Ansatz:

Wir haben einen fluorometrischen Assay entwickelt, der auf der Fluoreszenzdetektion von NADH basiert (Anregung/Emission: 340/460 nm). Die Assay-Parameter – einschließlich Cofaktor-Konzentration, pH-Wert und Temperatur – wurden optimiert, um das Verhältnis von Signal zu Hintergrund zu verbessern. Die Methode wurde auf Linearität validiert und für 96-Well-Platten zur parallelen Verarbeitung angepasst.

Ergebnis:

Der endgültige Test erreichte eine hohe Sensitivität und erkannte Aktivitätsunterschiede von bis zu 5 %. Die optimierte Plattform ermöglichte eine schnelle Identifizierung der leistungsstärksten Varianten und reduzierte die Screening-Zeit um 60 % im Vergleich zu herkömmlichen spektrophotometrischen Tests.

Fall 3: LC-MS-basierter Aktivitätsassay zur Profilierung von Substratspezifitätsverschiebungen

Kundenbedarf:

Ein pharmazeutisches Entdeckungsteam, das eine Mutantenbibliothek des Cytochrom P450 entwickelt, musste Verschiebungen in der Substratspezifität über mehrere Prodrug-Kandidaten hinweg bewerten. Da viele Substrate und Produkte überlappende UV-Absorptionsprofile aufwiesen, konnten traditionelle spektrophotometrische Assays sie nicht zuverlässig unterscheiden. Der Kunde benötigte eine selektive, quantitative Methode, die mit Hochdurchsatz-Screening kompatibel ist.

Unser Ansatz:

Wir haben einen auf LC-MS basierenden Aktivitätstest entwickelt, der in der Lage ist, mehrere Substrat-Produkt-Paare in einem einzigen Durchgang zu detektieren. Nach der Untersuchung der Ionisierungseffizienzen und Fragmentierungsmuster haben wir optimierte MRM-Übergänge für jede Verbindung festgelegt. Die Probenvorbereitung wurde in einen 96-Well-Workflow miniaturisiert, und die chromatographischen Bedingungen wurden verfeinert, um die Laufzeit zu verkürzen, ohne die analytische Trennung zu beeinträchtigen.

Ergebnis:

Die Methode lieferte eine klare, eindeutige Produktdetektion und eine robuste Aktivitätsquantifizierung. Der Kunde screente seine gesamte Bibliothek innerhalb einer Woche und identifizierte mehrere P450-Varianten mit unterschiedlichen Substratpräferenzverschiebungen, was gezielte nachfolgende Ingenieureingriffe ermöglichte.

Häufig gestellte Fragen

F: Welche Arten von Enzymen können Sie Tests entwickeln?

A: Wir entwerfen Assays für alle Enzymklassen, einschließlich Oxidoreduktasen, Hydrolasen, Transferasen, Isomerasen, Ligasen und Lyasen.
Q: Können Sie einen bestehenden Test modifizieren, um die Leistung zu verbessern?

A: Ja. Wir können bestehende Assays optimieren, um die Signalstärke, Reproduzierbarkeit oder Kompatibilität mit Hochdurchsatzformaten zu verbessern.
F: Stellen Sie die Reagenzien und Substrate zur Verfügung?

A: Wir können gebrauchsfertige Assay-Reagenzien und Substrate bereitstellen oder detaillierte Beschaffungsinformationen im endgültigen Protokoll zur Verfügung stellen.
Q: Wie stellen Sie die Reproduzierbarkeit von Assays sicher?

A: Jede Analyse unterliegt einer strengen Validierung, um Präzision, Signalstabilität und lineare Reaktion über biologische Replikate hinweg sicherzustellen.
Q: Können Assays in automatisierte Screening-Systeme integriert werden?

A: Ja. Unsere Tests sind mit robotergestützten Flüssigkeitshandhabungssystemen und standardmäßigen Mikrotiterplattenlesern kompatibel.
F: Wie werden Daten analysiert und berichtet?

A: Wir stellen Roh- und verarbeitete Daten zur Verfügung, einschließlich Hintergrundkorrekturen, Signal-Rausch-Berechnungen und Leistungskennzahlen.
Q: Sind vertrauliche Projekte geschützt?

A: Absolut. Alle Projektinformationen und Ergebnisse sind streng vertraulich, und das geistige Eigentum bleibt beim Kunden.

Referenzen:

Trovão M, Schüler LM, Machado A, u. a.Zufällige Mutagenese als vielversprechendes Werkzeug zur Verbesserung von Mikroalgenstämmen für die industrielle Produktion. Marine Arzneimittel2022;20(7):440. doi:10.3390/md20070440

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Nur für Forschungs- und Industriezwecke. Nicht für den persönlichen Gebrauch bestimmt. Bestimmte Produkte in Lebensmittelqualität eignen sich für die Formulierungsentwicklung in Lebensmitteln und verwandten Anwendungen.

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