Achromopeptidase

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Einführungen

Achromopeptidase ist eine Serinprotease, die spezifisch die C-terminalen Aminosäurereste von Lysin (einschließlich Prolin und Glutamat) spaltet und weitreichend in der Proteomforschung, Peptidsequenzierung, Insulinvorbereitung, Identifizierung phosphorylierter Peptide, Analyse von Disulfidbrücken, N-Glykan-Analyse usw. verwendet wird. Es hat ein großes Potenzial für kommerzielle Anwendungen, wie die Detektion von glykosyliertem Hämoglobin und die Reinigung von Kontaktlinsen.

Genstruktur

Achromopeptidase besteht aus einem Signalpeptid, einem Pro-Peptid, einer reifen Peptidase und einem Erweiterungspeptid. Das Achromopeptidase-Pro-Peptid von P. ilyticaus und Lenzymogenesc hatte 653 bzw. 670 Aminosäuren, während das Achromopeptidase-Pro-Peptid von P. aeruginosa nur 462 Aminosäuren hatte.

Proteinstruktur

Achromopeptidase enthält drei Paare von Disulfidbrücken, von denen die Disulfidbrücke C-S der Bestimmungsfaktor für ihre optimale enzymatische Aktivität und Denaturierungsresistenz unter mechanischen Bedingungen (pH 8,5 ~ 10,7) ist. Das katalytische Triade von H57, D113 und S194 entspricht dem katalytischen Triade von H57, D102 und S195lR von Trypsin.

Spezifität

Die Substratbindungsstelle von Achromopeptidase ist auch als S1 'Spezifitätstasche bekannt. Ihre räumliche Geometrie bestimmt ihre hohe Spezifität, und TLCK kann die S1-Spezifitätstasche anstelle des Peptidsubstrats einnehmen, wodurch die enzymatische Aktivität von Achromopeptidase effektiv gehemmt wird. Die Substratbindungsstelle von D225 bildet eine enge SI-Tasche mit dem benachbarten T189, S214, die nur lineare Seitenketten aufnehmen kann. Unter den Aminosäuren sind nur die linearen Seitenketten von Arginin und Lysin lang genug, um den Boden der Sl-Tasche zu erreichen, aber die Seitenkette von Arginin ist räumlich von D225 blockiert, was die Bindung von Arginin an die Sl-Tasche verhindert. Diese einzigartige geometrische räumliche Struktur erklärt das Prinzip, dass es ausschließlich die C-terminalen Aminosäurereste von Lysin spalten kann.

Optimale pH

Ein neutrales Umfeld (pH 6,0~7,0) ist die beste Bedingung für die Protease, um das Substrat in Peptidfragmente umzuwandeln; die Ansammlung von WI69 und H210 im katalytischen Zentrum bestimmt den optimalen pH-Wert von Achromopeptidase als alkalisch; daher wird die Mutation dieser Stelle zum Schlüssel zur Lösung des Problems.

Selbstabbau

Achromopeptidase neigt zu Autodegradation, was ein wichtiger Faktor ist, der ihre Anwendung einschränkt. Für Protease IV sind ihre Selbstabbau-Stellen K30, K48, K49, Kl55 und K203, die 5kDa, 6kDa, 13kDa, 18kDa und 22kDa Abbaufragmente erzeugen können. Die Mutation oder chemische Modifikation dieser Lysin-Stellen kann die Neigung zur Selbstabbau verringern. Die Stabilität von Achromopeptidase kann verbessert werden, aber es kann auch zu Veränderungen in der räumlichen Struktur kommen und die enzymatische Aktivität beeinflussen.

Anwendungen

• Proteomik

Die Proteomik ist eine Disziplin, die sich der großflächigen Untersuchung der Proteinstruktur und -funktion widmet, und die vollständige enzymatische Verdauung von Proteinkomplexen ist eine moderne Hochauflösung. Hochdurchsatz-Massenspektrometrie ist ein entscheidender Schritt bei der Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen. Achromopeptidase ist ein essentielles Werkzeug für die Proteomforschung.

• Peptidsequenzierung

Die kombinierte Lys-C- und Lys-N-Verdauung, gefolgt von LC-MS/MS-Analyse, ermöglicht die Sequenzierung und Identifizierung der N-terminalen Enden verschiedener Proteine in einem Gemisch von Proteinen, einschließlich acetylierter N-terminaler Enden, Protein-Isomeren usw.