ACS3

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Acetat ist eine in der Natur sehr häufig vorkommende kurzkettige Fettsäure und wird in zahlreichen Stoffwechselprozessen von Eukaryoten und Prokaryoten genutzt. In prokaryotischen Zellen haben sich drei unterschiedliche Stoffwechselwege entwickelt, um diese kurzkettige Fettsäure in Acetyl‑Coenzym A (Ac‑CoA) umzuwandeln. Über diese Wege können Prokaryoten Acetat als Kohlenstoff- und Energiequelle verwerten. Einer dieser Wege nutzt die Enzyme Acetatkinase (AckA, EC 2.7.2.1) / Phosphotransacetylase (Pta, EC 2.3.1.8), um Acetat über Acetatphosphat (Ac‑P) zu aktivieren und in Ac‑CoA zu überführen. Der zweite Weg besteht aus der Ac‑CoA‑Synthase (ADP‑bildend), und der dritte Weg aus der Ac‑CoA‑Synthetase (AMP‑bildend). Die Acetyl‑CoA‑Synthase (ADP‑bildend, EC 6.2.1.1.3) katalysiert die reversible Reaktion von Acetat + ATP      ADP + Pi + Ac‑CoA.

Abbildung 1. Stoffwechselwege zur Umwandlung von Acetat in Ac‑CoA (Starai, V. J.; Escalante‑Semerena, J. C. 2004)

Das AMP‑bildende Enzym Acetyl‑CoA‑Synthetase (Acs) ist in der Natur konserviert

AMP‑bildende Enzyme katalysieren die Produktsynthese über Acyl‑AMP‑Zwischenprodukte und sind an zahlreichen anabolen Prozessen beteiligt. Aufgrund der Bedeutung dieses Enzyms haben viele Enzymologen, Molekularbiologen, Zellphysiologen und Strukturbiologen begonnen, dieses Enzym eingehend zu untersuchen. Acs‑Orthologe finden sich in Bakterien, einigen thermophilen und extrem thermophilen Archaeen sowie in Eukaryoten, einschließlich Pilzen, Pflanzen und dem Menschen. Bioinformatische Studien haben gezeigt, dass alle Acs‑Orthologe einen gemeinsamen Ursprung haben. Über das gesamte Acs‑Protein hinweg existieren zahlreiche konservierte Regionen; zudem weisen die Proteine eine weitgehend vergleichbare Größe (~70 kDa) auf. Dieses Phänomen der Größenkonservierung deutet darauf hin, dass die vorhandene Acs vermutlich die kleinste Struktur darstellt, die zur Katalyse der beiden Teilreaktionen (Abbildung 1B) erforderlich ist, und dass in der Natur kein größeres Enzym benötigt wird.

Abbildung 2. Struktur der Acs aus S. enterica (Starai, V. J.; Escalante‑Semerena, J. C. 2004)

Synthese von Acetyl‑CoA durch die AMP‑bildende Acetyl‑CoA‑Synthetase

Acs katalysiert die Synthese von Ac‑CoA über einen Bi‑Uni‑Uni‑Bi‑Ping‑Pong‑Mechanismus. Das Enzym bindet zunächst ATP und anschließend Acetat, wodurch enzymgebundenes Acetyl‑AMP gebildet und Pyrophosphat freigesetzt wird. Ac‑CoA entsteht, nachdem CoA an Acs gebunden hat. Die Reaktion endet mit der sequenziellen Freisetzung von Ac‑CoA und AMP. Das Verständnis darüber, wie Acs Ac‑CoA synthetisiert, ist weiterhin unvollständig. Durch kinetische und strukturelle Analysen von Wildtyp‑ und Mutanten‑Acs sowie anderer AMP‑bildender Enzyme, die aus einer Vielzahl von Organismen isoliert wurden, wird die Funktion dieses Enzyms schrittweise aufgeklärt.

Regulation der acs-Genexpression

Die transkriptionelle Regulation von acs im gramnegativen Bakterium Escherichia coli ist am besten charakterisiert. In E. coli wird die acs-Expression in der mittleren exponentiellen Phase induziert, erreicht ihr Maximum beim Übergang der Zellen in die stationäre Phase und nimmt mit zunehmendem Alter der Kultur ab. Die Transkription von acs wird durch Glukose gehemmt, da sie durch das Crp‑Protein (catabolite inhibitory protein) als Antwort auf ansteigendes zyklisches AMP (cAMP) aktiviert wird. In diesem Bakterium ist acs das promotornahe Gen eines Drei‑Gen‑Operons, das einen Acetattransporter (kodiert durch actP) sowie ein Gen unbekannter Funktion, yjcH, umfasst. Die Funktion von ActP ist nur relevant, wenn die Acetatkonzentration in der Umgebung sehr niedrig ist. Die Aktivierung von acs durch Crp erfolgt über einen synergistischen Typ‑III‑Mechanismus, bei dem Crp die Housekeeping‑s⁷⁰‑RNA‑Polymerase auf acsP2 konzentriert, um einen hoch effizienten offenen Komplex zu bilden. Die regulatorische Region von acs enthält eine proximale (CrpI, Zentrum bei –69,5) und eine distale (CrpII, Zentrum bei –122,5) Crp‑Bindestelle. Die hochaffine CrpI‑Bindestelle ist für die acs-Expression erforderlich; für eine optimale Expression ist jedoch die koordinierte Aktivierung beider Stellen notwendig. In der regulatorischen Region von acs sind zudem drei Bindestellen für die Proteine Fis (factor for inversion stimulation; FisI‑III) und Ihf (integration host factor; IhfI‑III) vorhanden.

Posttranslationale Regulation der Acs‑Aktivität

Die Forschung zur posttranslationalen Regulation von Acs hat erst in den letzten Jahren Fortschritte erzielt. Interessanterweise ist das Sir2‑(Sirtuin‑)abhängige System der Protein‑Acetylierung/Deacetylierung (SDPADS), das für die Kontrolle der Acs‑Aktivität verantwortlich ist, auch an der Regulation der eukaryotischen Genexpression beteiligt. Aus metabolischer Sicht ist das wichtigste Merkmal von SDPADS, dass es den Kofaktor NAD⁺ verbraucht; seine Aktivität muss daher durch die Zelle strikt kontrolliert werden. Acs ist das erste Stoffwechselenzym, das in Prokaryoten und Eukaryoten durch SDPADS reguliert wird. Es besteht eine Verknüpfung zwischen der Acs‑Aktivität (Kohlenstoffmetabolismus) und der NAD⁺‑Biosynthese (Energiegewinnung). Es wird vermutet, dass zu niedrige NAD⁺‑Spiegel der Zelle einen niedrigen Energiezustand signalisieren und dadurch eine Herunterregulation energieverbrauchender Antworten (wie der Acs‑Antwort) auslösen können. Derzeit ist unser Verständnis darüber, wie Acetylasen und Deacetylasen mit ihren Substraten interagieren, begrenzt. Da das Enzym hinsichtlich seiner Kinetik gut charakterisiert ist und auch die Konformation bekannt ist, die die beiden Teilreaktionen katalysiert, kann Acs als geeignetes Modellsystem dienen, um diese Interaktionen weiter aufzuklären.