Alanin-Racemase

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Alanin-Racemase (Alr), auch als L‑Alanin‑Racemase bezeichnet, ist ein ubiquitär vorkommendes prokaryotisches Enzym. Dieses Enzym gehört zur Familie der Isomerasen, die auf Aminosäuren und deren Derivate wirken, und ist am Stoffwechsel von Alanin und Aspartat beteiligt. Die Alanin‑Racemase nutzt Pyridoxal‑5′‑phosphat (PLP), um die Racemisierung von L‑Alanin zu katalysieren und D‑Alanin für die Zellwandsynthese bereitzustellen. Das Enzym ist in Bakterien weit verbreitet, was die Alanin‑Racemase zu einem attraktiven Target für die Entwicklung antibakterieller Arzneistoffe macht; in einigen Bakterien existieren jedoch alternative Biosynthesewege für D‑Alanin, sodass die Alanin‑Racemase in diesen Spezies nicht als antibakterielles Target geeignet ist. In Eukaryoten wie aquatischen Tieren, Pilzen und Pflanzen finden sich nur wenige ähnliche Enzyme. Die Genomsequenz des methanogenen Archaeons Methanococcus maripaludis zeigt, dass das Gen der Alanin‑Dehydrogenase benachbart zur Alanin‑Racemase und zur Alanin‑Permease liegt. Zusätzlich zu ihrer Funktion bei der Nutzung von D‑Alanin kann Alr das System auch vor einer D‑Alanin‑Inhibition schützen, da das Wachstum von Alr‑Mutanten auf einem Gemisch aus D‑ und L‑Alanin beeinträchtigt war. Jüngere Studien zeigten, dass in Chlamydia pneumoniae, dem Gene fehlen, die für Alanin‑Racemase und DadX‑Homologe kodieren, die Serin‑Hydroxymethyltransferase GlyA als Quelle für D‑Alanin dienen kann.

Struktur der Alanin‑Racemase

Zahlreiche Kristallstrukturen von Alr sowie von Inhibitor‑Komplexen wurden aufgeklärt. Eine der am besten untersuchten Strukturen ist Alr (PDB‑ID: 1SFT) aus Geobacillus stearothermophilus, die ein 388 Aminosäuren umfassendes homodimeres Enzym zeigt, das durch eine Kopf‑zu‑Schwanz‑Assoziation zweier Monomere gebildet wird. Jedes Monomer besteht aus zwei gefalteten Domänen: (i) der N‑terminalen Domäne (AS 1–240) und (ii) der C‑terminalen Domäne (AS 241–388).

Die N‑terminale Domäne besteht aus einem achtsträngigen α/β‑Barrel, während die C‑terminale Domäne ausschließlich aus β‑Strängen aufgebaut ist. Molekulardynamische Studien haben gezeigt, dass sich in den beiden aktiven Zentren der Alr‑Homodimere Wassermoleküle befinden. Da dieses Wassermolekül eine wichtige Rolle spielt, sollte es bei der Inhibitor‑Entwicklung umfassend berücksichtigt werden. Das aktive Zentrum in jedem Alr‑Monomer enthält PLP‑Bindungsreste, die kovalent an Lys39 gebunden sind, sowie Aminosäuren in der unmittelbaren Umgebung des Pyridoxal‑Kofaktors. Lys39 befindet sich am C‑Terminus der ersten β‑Kette des α/β‑Barrels, und seine Seitenkette zeigt in Richtung des Barrel‑Zentrums. Der Neigungswinkel, unter dem die katalytischen Domänen der jeweiligen Monomere zueinander orientiert sind, beträgt 125°. Folglich ragt der Lys39‑Rest auch in die Spalte, die durch die beiden Domänen des Monomers gebildet wird, während sich die PLP‑Gruppe ungefähr im Zentrum des Barrels positioniert, näher an der zweiten Domäne des jeweils anderen Monomers. 

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Bacillus stearothermophilus‑Alr‑Homodimers (PBD‑ID: 1SFT) (Azam, M.A.; Jayaram, U. 2016)

Inhibitoren der Alanin‑Racemase

Die Suche nach Inhibitoren des Alr‑Enzyms begann 1966, als Lynch und Neuhaus den Wirkmechanismus von O‑Carbamoyl‑D‑Serin in Streptococcus faecalis erläuterten. In dieser Studie wurde O‑Carbamoyl‑D‑Serin als wirksamer Alr‑Inhibitor identifiziert und durch enzymkinetische Untersuchungen untermauert. Der Schwerpunkt der Arbeiten lag darauf, die primäre Wirkstelle von O‑Carbamoyl‑D‑Serin an Alr zu bestimmen und diese mit anderen potenziellen Wirkstellen wie D‑Ala‑D‑Ala‑Synthetase, D‑Ala‑D‑Ala‑Additionsenzym und Phospho‑NAc‑Muramyl‑Pentapeptid‑Translokase zu vergleichen.

Es wurde zudem beobachtet, dass 200 µg/mL des D‑Isomers keinen Effekt auf Streptococcus lactis, Lactobacillus arabinosus und E. coli hatten; diese Ergebnisse stimmen mit den von Neuhaus und Lambert 1972 berichteten Daten überein. Sie zeigten außerdem, dass L‑Cycloserin ein wirksamer kompetitiver Inhibitor ist; zuvor war L‑Cycloserin als unwirksam hinsichtlich der Inhibition der Alr aus Staphylococcus aureus angesehen worden. Atherton et al. synthetisierten das L‑Alanin‑Analogon Alafosfalin, das sich als selektiver Inhibitor der Peptidoglykan‑Biosynthese sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien erwies. Es erhöht die Akkumulation von Diphosphat‑N‑Acetyl‑Muramyl‑Tripeptid in grampositiven Organismen und senkt die intrazellulären D‑Alanin‑Spiegel. In Bakterien wird Alafosfalin über stereospezifische Peptid‑Permeasen transportiert und schließlich durch intrazelluläre Aminopeptidasen zu 1‑Aminoethylphosphonsäure hydrolysiert. Die Zielstruktur der 1‑Aminoethylphosphonsäure ist das Alr‑Enzym, das in gramnegativem E. coli reversibel und kompetitiv gehemmt wird und grampositive Organismen wie Staphylococcus aureus und Staphylococcus faecalis zeitabhängig irreversibel inhibiert.

Abbildung 2. Struktur der Alr‑Inhibitoren O‑Carbamyl‑D‑Serin und Alafosfalin (Azam, M.A.; Jayaram, U. 2016)