Alanine Racemase

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Alanine-Racemase (Alr), auch bekannt als L-Alanin-Racemase, ist ein ubiquitär vorkommendes prokaryotisches Enzym. Dieses Enzym gehört zur Familie der Isomerasen, die auf Aminosäuren und deren Derivate wirken, und ist am Stoffwechsel von Alanin und Aspartat beteiligt. Alanin-Racemase nutzt Pyridoxal-5'-phosphat (PLP), um die Racemisierung von L-Alanin durchzuführen und D-Alanin für die Synthese der Zellwand bereitzustellen. Das Enzym ist in Bakterien weit verbreitet, was Alanin-Racemase zu einem attraktiven Ziel für die Entwicklung antibakterieller Medikamente macht, jedoch gibt es in einigen Bakterien alternative Wege zur Synthese von D-Alanin, sodass Alanin-Racemase nicht als antibakterielles Ziel für diese Bakterien dienen wird. In Eukaryoten wie aquatischen Tieren, Pilzen und Pflanzen sind nur wenige ähnliche Enzyme zu finden. Die Genomsequenz des methanogenen Archaea, Methanococcus maripaludis, zeigt, dass das Alanin-Dehydrogenase-Gen benachbart zu Alanin-Racemase und Alanin-Permease liegt. Neben seiner Funktion bei der Nutzung von D-Alanin kann Alr auch das System vor der Hemmung durch D-Alanin schützen, da das Wachstum von Alr-Mutanten in der Mischung aus D- und L-Alanin beeinträchtigt war. Neuere Studien haben gezeigt, dass in Chlamydia pneumoniae, die Gene codieren, die Alanin-Racemase und DadX-Homologe fehlen, die Serin-Hydroxymethyl-Transferase GlyA als Quelle für D-Alanin verwendet werden kann.

Struktur der Alanin-Racemase

Viele Kristallstrukturen von Alr und Inhibitor-Komplexen wurden aufgeklärt. Eine der am besten untersuchten Strukturen ist Alr (PDB ID: 1SFT) von Geobacillus stearothermophilus, die ein 388-Rest- homodimeres Enzym zeigt, das durch eine Kopf-an-Schwanz-Assoziation von zwei Monomeren gebildet wird. Jedes Monomer besteht aus zwei gefalteten Domänen: (i) der N-terminalen Domäne, die aus 1-240aa gebildet wird, und (ii) der C-terminalen Domäne, die aus 241-388aa gebildet wird.

Die N-terminale Domäne besteht aus einem achtsträngigen α/β-Fass, und die C-terminale Domäne besteht nur aus β-Strängen. Molekulardynamik-Studien haben gezeigt, dass sich Wassermoleküle in den beiden aktiven Stellen der Alr-Homodimere befinden. Da dieses Wassermolekül eine wichtige Rolle spielt, sollte es bei der Gestaltung von Inhibitoren vollständig berücksichtigt werden. Die aktive Stelle in jedem Monomer von Alr enthält Pyridoxal-5'-phosphat (PLP)-Bindungsreste, die kovalent an Lys39 gebunden sind, sowie Aminosäuren in der unmittelbaren Umgebung des Pyridoxal-Kofaktors. Lys39 befindet sich am C-Terminus der ersten β-Kette des α/β-Fasses, und seine Seitenkette zeigt zur Mitte des Fasses. Der Winkel, in dem die katalytischen Domänen jedes Monomers zueinander geneigt sind, beträgt 125°. Daher erstreckt sich das Lys39-Rest auch in die Spalte, die von den beiden Domänen des Monomers gebildet wird, während sich die PLP-Einheit in der ungefähren Mitte des Fasses positioniert, näher an der zweiten Domäne des anderen Monomers. 

Abbildung 1. Piktoriale Ansicht des Bacillus stearothermophilus Alr-Homodimers (PBD ID: 1SFT) (Azam, M.A.; Jayaram, U. 2016)

Inhibitoren der Alanin-Racemase

Die Suche nach Inhibitoren des Alr-Enzyms begann 1966, als Lynch und Neuhaus den Wirkmechanismus von O-Carbamoyl-D-Serin in Streptococcus faecalis erklärten. In dieser Studie wurde festgestellt, dass O-Carbamoyl-D-Serin ein effektiver Alr-Inhibitor ist, was durch enzymkinetische Studien unterstützt wurde. Der Fokus der Forschung liegt darauf, die primäre Wirkungsstelle von O-Carbamoyl-D-Serin auf Alr zu bestimmen und sie mit anderen Wirkungsstellen wie D-Ala-D-Ala-Synthetase, D-Ala-D-Ala-Hinzufügensenzym und Phospho-NAc-Muramyl-Pentapeptid-Translokase zu vergleichen.

Es wurde auch beobachtet, dass 200 μg/mL D-Isomer keinen Einfluss auf Streptococcus lactis, Lactobacillus arabinosus und E. coli hatte; diese Ergebnisse stimmen mit denen überein, die von Neuhaus und Lambert 1972 berichtet wurden. Sie bewiesen auch, dass L-Cycloserin ein effektiver kompetitiver Inhibitor ist, und zuvor wurde L-Cycloserin als ineffektiv für die Hemmung von Staphylococcus aureus Alr angesehen. Atherton et al. synthetisierten das L-Alanin-Analogon Alafosfalin, das als selektiver Inhibitor der Peptidoglykan-Biosynthese sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien gefunden wurde. Es erhöht die Ansammlung von Diphosphat-N-Acetyl-Muramyl-Tripeptid in grampositiven Organismen und reduziert die intrazellulären Spiegel von D-Alanin. In Bakterien wird Alafosfalin durch stereospezifische Peptid-Permeasen transportiert und schließlich von intrazellulären Aminopeptidasen in 1-Aminoethylphosphonsäure hydrolysiert. Die Zielstelle von 1-Aminoethylphosphonsäure ist das Alr-Enzym, das in gramnegativen E. coli reversibel und kompetitiv gehemmt wird und grampositive wie Staphylococcus aureus und Staphylococcus faecalis in zeitabhängiger Weise irreversibel hemmt.

Abbildung 2. Struktur des Alr-Inhibitors O-Carbamyl-D-Serin und Alafosfalin (Azam, M.A.; Jayaram, U. 2016)