Apase

Die saure Phosphatase (AP/APase) (Orthophosphorsäure-Monoester-Phosphohydrolase, EC 3.1.3.2) katalysiert unter sauren Bedingungen bei pH 4–7 die Hydrolyse von Phosphat-Monoestern. Einige Mitglieder der AP-Familie sind Metallohydrolasen mit zwei heterovalenten Metallionen im katalytischen Zentrum. Die meisten Isoformen weisen aufgrund eines Ladungstransfers von einem Tyrosinrest auf Fe(III) eine charakteristische violette Färbung auf. Daher werden sie als violette saure Phosphatasen (purple acid phosphatase, PAP) bezeichnet. Sie werden auch als tartratresistente saure Phosphatasen (tartrate-resistant acid phosphatases, TRAP) bezeichnet, da sie gegenüber einer Hemmung durch L(+)-Tartrat unempfindlich sind, während einige Isoformen tartratempfindlich sind. AP ist in der Natur weit verbreitet und wurde in Pflanzen, Tieren sowie in niederen Organismen wie Bakterien und Pilzen untersucht. Sie spielt eine wesentliche Rolle in verschiedenen Stoffwechselprozessen.

Verbreitung

AP ist in allen lebenden Systemen von niederen bis zu höheren Organismen weit verbreitet. Verschiedene Pflanzenteile, wie die Zellwand von Pisum sativum und Nicotiana tobaccum, das Phloem von N. tobaccum sowie der Spross von Vigna aconitifolia, exprimieren AP. Bei Tieren wurde sie aus Rind, menschlicher Milz, Knochen und Makrophagen isoliert. Darüber hinaus wurde die prostatische AP aus Prostata, Leber, Milz und Gehirn charakterisiert. Lysosomale AP wurde aus den Lysosomen von Mastzellen isoliert. Sie wurde auch in Pilzarten beschrieben. In Saccharomyces cerevisiae ist sie im periplasmatischen Raum, in der Zellwand und in einigen Zellorganellen lokalisiert. Einige prokaryotische Genome tragen ebenfalls Sequenzen, die zu humaner und pflanzlicher PAP homolog sind.

Molekularstruktur

Jede Untereinheit der HMW-PAP aus Pflanzen besitzt zwei Domänen. Die erste ist eine Amino-Domäne unbekannter Funktion, die durch sandwichartig angeordnete β-Faltblätter gebildet wird, und die zweite ist die katalytische Domäne, d. h. die Carboxyl-Domäne. Die katalytische Domäne ist durch gemischte β-Faltblätter (α/β-Stränge) strukturiert. Im Gegensatz dazu besitzt die LMW-TRAP aus Säugetieren nur eine Domäne, die der katalytischen Domäne der pflanzlichen PAP ähnelt. PAPs bestehen im Allgemeinen aus zwei Metallionen, die im aktiven Zentrum zwei Koordinationssphären mit sieben hochkonservierten Aminosäure-Liganden bilden.

Es wurde beobachtet, dass bei PAP/TRAP von den zwei Metallionen eines ein dreiwertiges Eisenion (Fe3+) ist, das am Ladungstransfer mit einem Tyrosinrest beteiligt ist, und das zweite ein zweiwertiges Metallion, das Fe, Zn oder Mn sein kann. Säugetier-TRAP enthält Fe(II) als zweite Metallbindungsstelle; entsprechend weisen PAPs pflanzlichen und prokaryotischen Ursprungs Zn(II) oder Mn(II) als zweiwertiges Metallion auf. Ein spezifisches Muster von sieben Aminosäureresten, die an der Metall-Ligand-Koordination beteiligt sind, ist bei den meisten Spezies von Prokaryoten bis Eukaryoten invariant. Diese einzigartige Sequenz kann daher als Signatursequenz von PAP/TRAP betrachtet werden. Fe(III) ist mit einem Tyrosin-, einem Histidin- und einem Aspartatrest koordiniert, und M(II) ist mit einem Asparagin- und zwei Histidinresten koordiniert. APs sind überwiegend Glykoproteine mit N-glykosidisch gebundenen Oligosaccharidketten. Bei Enzymuntereinheiten verschiedener Spezies wurden spezifische N-Glykosylierungsstellen am Aminoterminus identifiziert.

Katalytischer Mechanismus

Abbildung 1. Vorgeschlagener katalytischer Mechanismus für PAP. (Schenk G; et al. 2008)

Da die katalytische Stelle der AP in Pflanzen, Tieren und Bakterien teilweise homolog ist, könnten diese einem ähnlichen katalytischen Mechanismus folgen. Obwohl die Kristallstruktur der AP aus verschiedenen Quellen umfassend untersucht wurde, bedarf der katalytische Mechanismus dieses Enzyms weiterer Aufklärung. Es wurden mehrere Hypothesen zu ihrem Reaktionsmechanismus vorgeschlagen. Nach dem von Klabunde et al. für PAP aus roter Kidneybohne vorgeschlagenen Mechanismus bindet das zweiwertige Metallion an die monodentate Phosphatgruppe des Substrats, und ein an Fe(III) gebundenes Hydroxidion wirkt als Nukleophil; der für Süßkartoffel vorgeschlagene Mechanismus beschreibt hingegen eine tripodale Koordination des Substrats mit zwei Metallspezies, wobei die heterovalenten Metallionen im aktiven Zentrum über zwei Sauerstoffatome der Phosphatgruppe des Substrats verbrückt sind und ein drittes Phosphat-Sauerstoffatom, das beide Metallionen verbrückt, die Hydrolyse initiiert. Das dreiwertige Fe-Metall aktiviert das Nukleophil, d. h. die metallgebundene μ-Hydroxo-Gruppe, die die Phosphoesterbindung spaltet. Eine umfassende Strukturanalyse der PAP aus roter Kidneybohne liefert Einblicke in ihr katalytisches Verhalten. Darüber hinaus zeigen einige Metall-Austauschstudien die Bedeutung der Metallionen für ihre katalytischen Eigenschaften. Mutagenese- und kristallographische Studien beschreiben zudem eine Repressionsschleife in der Säugetier-TRAP, die die katalytische Aktivität reguliert, indem sie die Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes hemmt. In der Kristallstruktur der humanen PAP wirkt die Carboxyl-Seitenkette von Asp145 in dieser Schleife als bidentater Ligand, der zwei Metallionen verbrückt, und blockiert dadurch die katalytische Stelle.

Anwendungen

• Entwicklung stressresistenter Pflanzensorten

Pi-Düngemittel stammen aus nicht erneuerbaren Quellen wie Phosphatgestein, und eine übermäßige Anwendung erhöht die Eutrophierung in Gewässern. Um diese nicht erneuerbaren natürlichen Ressourcen und die Umwelt zu schonen, wird eine nachhaltige Landwirtschaft zunehmend gefördert. Gentechnik in Pflanzen ist einer der revolutionären Ansätze zur Verbesserung von Kulturpflanzensorten. Dadurch können Pi-Mangel-induzierbare Gene in Pflanzen eingeführt werden, um Phosphormangel zu überwinden. Bis heute wurden verschiedene Isoformen Pi-Mangel-induzierbarer PAP aus unterschiedlichen pflanzlichen Quellen wie A. thaliana, N. tobaccum und P. vulgaris isoliert und detailliert charakterisiert.

• TRAP in klinischer Diagnostik und Prognose

Beim Menschen sind die TRAP-Isoformen 5a und 5b in verschiedenen Geweben verteilt. Dimeres TRAP 5b wird hauptsächlich in Osteoklasten exprimiert, während TRAP 5a von Immunzellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen produziert wird, die mit der Pathogenverarbeitung assoziiert sind. Beide Isoformen können als Marker für chronische Entzündungen in unterschiedlichen Organen bzw. für knochenbezogene Erkrankungen wie Osteoporose, Knochenmetastasen bei Krebs etc. verwendet werden.

• Immobilisierte AP

Die wichtigste Anwendung immobilisierter Enzyme ist die Konstruktion verschiedener Typen von Biosensoren. Diese Sensoren sind sehr nützlich für den Nachweis von Umweltkontaminanten und Schwermetallen. Ein amperometrischer Biosensor unter Verwendung von AP und Polyphenoloxidase wurde zur Detektion einer As(V)-Kontamination in Wasser konstruiert.

Literatur