AST

Aspartat-Aminotransferase (EC 2.6.1.1; AspAT) ist ein pyridoxal-5'-phosphat (PLP)-abhängiges Enzym, das die reversible Transaminierung zwischen Aspartat und 2-Oxoglutarat katalysiert, um Oxalacetat und Glutamat zu erzeugen. AspAT ist weit verbreitet in Pflanzen, Mikroorganismen und Tieren und spielt eine sehr wichtige Rolle im Prozess des Stickstoff- und Kohlenstoffmetabolismus in Zellen. Es spielt auch eine Rolle in der Ureagenese und ist an der Übertragung von reduzierenden Äquivalenten zu den Mitochondrien über den Aspartat/Malat-Shuttle beteiligt. Es ist hauptsächlich verantwortlich für die reversible Reaktion zwischen sauren Aminosäuren und Ketoäuren. Die Transaminierung der Aminogruppe erfolgt durch die Umwandlung des Coenzyms zwischen Pyridoxalphosphat und Pyridoxaminphosphat. Mit der Entwicklung der Biotechnologie haben immer mehr Forscher seinen katalytischen Mechanismus auf struktureller Ebene durch molekulare Simulation und andere Methoden untersucht und die Modifikation und das vernünftige Design von Enzymen geleitet.

Eigenschaften

1984 berichteten Kondo. K et al. über die vollständige Aminosäuresequenz von AspAT in E. coli und analysierten die Sequenzhomologie mit Vögeln und Säugetieren, die Ergebnisse zeigten, dass die Sequenzhomologie 40% beträgt. 1987 analysierten sie weiter die Aminosäuresequenz von E. coli AspAT und kamen zu dem Schluss, dass E. coli AspAT 396 Aminosäurereste mit einem Molekulargewicht von 4,35 kDa hatte. Außerdem fanden sie heraus, dass AspAT 55,8% unpolare Reste und 44,2% polare Reste enthält, die ähnlich sind wie Isoenzyme in Hühner- und Schweinemitochondrien. Laut der Homologie der Sequenz gehören AspATs zur Transaminase Klasse I. AspATs können auch in sieben Unterklassen gemäß der Sequenzhomologie unterteilt werden. Im Vergleich zu anderen Subtypen von AspATs und anderen Transaminasen mit unterschiedlicher Substratspezifität wurde AspATs von Iα umfassend und tiefgehend untersucht.

Struktur

In der frühen Phase wurde AspAT durch Punktmutationsversuche untersucht, um seine Struktur abzuleiten. 1986 erhielten Smith et al. seine dreidimensionale Struktur durch die Röntgenbeugungsmethode. E. coli AspAT ist ein homologes Dimer mit zwei identischen Untereinheiten, von denen jede in eine große Domäne und eine kleine Domäne unterteilt werden kann. Je nach Funktion jedes Teils in der Struktur kann jede Untereinheit in einen N-terminalen Arm (der für die Verbindungen zwischen zwei Untereinheiten verwendet wird, die Gesamtstruktur eines stabilen Enzyms), eine große Domäne (die für die Bindung von Coenzymen verwendet wird) und eine kleine Domäne (die für die Bindung von Untereinheiten verwendet wird) unterteilt werden. Wenn das Enzym an das Substrat bindet, bewegt sich die kleine Domäne in Richtung der größeren Domäne. Daher ist die Zusammensetzung der Schnittstelle zwischen den strukturellen Domänen wichtig, und es gibt in diesen Regionen im Allgemeinen hochkonservierte Sequenzen. Durch die Verwendung der Struktur einer vermuteten Aminotransferase von S. pomeroyi als Suchmodell diffraktierten die Kristalle von AspAT bis zu einer Auflösungsgrenze von 2,50 A˚ (Abb. 1) und seine dreidimensionale Struktur wurde durch die Molekularersatzmethode gelöst. Die Analyse der Selbstrotationsfunktion ergab, dass die vier Moleküle in der asymmetrischen Einheit des Kristalls anscheinend eine 222-molekulare Symmetrie aufweisen.

Abbildung 1. Ein repräsentatives Beugungsbild, das im Bereich von 1,0 Oszillation von einem einzelnen AspAT-Kristall gesammelt wurde.
(Deepak Chandra Saroj, et al. 2014)

Katalytischer Mechanismus

Die Biosynthese von Aspartat ist ein wesentlicher Weg, der für das Wachstum und das Überleben von Mycobacterium tuberculosis erforderlich ist. Die Strukturanalyse der Aspartat-Aminotransferase (AspAT) aus Mtb wird nicht nur eine Plattform für das strukturbasierte Design von kleinen Molekülinhibitoren bieten, sondern auch helfen, den detaillierten Mechanismus ihrer Katalyse zu erhellen. Unter physiologischen Bedingungen verwendet AspAT Ketoglutarat und Oxalessigsäure als Aminorezeptoren, während Glu und Asp als Aminodonoren fungieren. Es kann auf unterschiedliche Weise mit zwei Arten von Substraten interagieren. Das wichtigste Coenzym im Reaktionsprozess ist Pyridoxal-5'-phosphat (PLP), dessen ɛ-4 Kohlenstoffatom kovalent an die Aminogruppe von Lysin, dem aktiven Zentrum des Enzyms, bindet, um Aldimin zu bilden.

Abbildung 2. Reaktionsmechanismus der Aspartat-Aminotransferase.

AspAT hat zwei identische Untereinheiten, und das aktive Zentrum befindet sich an der Untereinheitenschnittstelle. Der Rest des aktiven Zentrums ist in verschiedenen Isoenzymen hochkonserviert. Jede Untereinheit hat eine Bindungsstelle für Substrate und Coenzyme. Das Hauptprinzip ist die Wechselwirkung zwischen der Guanidin-Gruppe mit dem Substrat über die positive Arginin-Bindung und die Carboxylgruppe des Substrats. In AspAT interagiert die Carboxylgruppe mit der terminalen Carboxylgruppe. AspAT war kovalent an das Lysinrest in Form einer Schiff-Basen-Bindung mit PIP als Coenzym gebunden. Durch die Umwandlung des Coenzyms zwischen PLP und PMP wurde der Prozess der Transaminierung gefördert.

Referenzen