AST

Aspartat-Aminotransferase (EC 2.6.1.1; AspAT) ist ein Pyridoxal-5′-phosphat(PLP)-abhängiges Enzym, das die reversible Transaminierung zwischen Aspartat und 2-Oxoglutarat katalysiert und dabei Oxalacetat und Glutamat bildet. AspAT kommt weit verbreitet in Pflanzen, Mikroorganismen und Tieren vor und spielt eine zentrale Rolle im Stickstoff- und Kohlenstoffstoffwechsel der Zelle. Darüber hinaus ist es an der Ureagenese beteiligt und wirkt über den Aspartat/Malat-Shuttle am Transfer reduzierender Äquivalente in die Mitochondrien mit. Es ist hauptsächlich für die reversible Reaktion zwischen sauren Aminosäuren und Ketosäuren verantwortlich. Die Transaminierung der Aminogruppe erfolgt über die Umwandlung des Coenzyms zwischen Pyridoxalphosphat und Pyridoxaminphosphat. Mit der Entwicklung der Biotechnologie untersuchten zunehmend mehr Forschende den katalytischen Mechanismus auf Strukturebene mittels molekularer Simulation und weiterer Methoden und leiteten daraus die Modifikation sowie das rationale Enzymdesign ab.

Eigenschaften

1984 berichteten Kondo K. et al. über die vollständige Aminosäuresequenz der AspAT aus E. coli und analysierten die Sequenzhomologie zu Vögeln und Säugetieren; die Ergebnisse zeigten eine Sequenzhomologie von 40 %. 1987 analysierten sie die Aminosäuresequenz der E. coli-AspAT weiter und kamen zu dem Schluss, dass die E. coli-AspAT 396 Aminosäurereste mit einem Molekulargewicht von 4,35 kDa aufweist. Zudem stellten sie fest, dass AspAT 55,8 % unpolare und 44,2 % polare Reste enthält, was den Isoenzymen in Hühner- und Schweinemitochondrien ähnelt. Auf Basis der Sequenzhomologie gehören AspATs zur Transaminase-Klasse I. AspATs lassen sich zudem anhand der Sequenzhomologie in sieben Unterklassen einteilen. Im Vergleich zu anderen AspAT-Subtypen sowie zu anderen Transaminasen mit unterschiedlicher Substratspezifität wurde AspAT der Unterklasse Iα umfassend und vertieft untersucht.

Struktur

In der frühen Phase wurde AspAT mittels ortsgerichteter Mutagenese untersucht, um Rückschlüsse auf die Struktur zu ziehen. 1986 bestimmten Smith et al. die dreidimensionale Struktur mittels Röntgenbeugung. Die E. coli-AspAT ist ein homodimeres Protein mit zwei identischen Untereinheiten, die jeweils in eine große und eine kleine Domäne unterteilt werden können. Entsprechend der Funktion der jeweiligen Strukturabschnitte lässt sich jede Untereinheit in einen N-terminalen Arm (für die Verknüpfung der beiden Untereinheiten und die Stabilisierung der Gesamtstruktur des Enzyms), eine große Domäne (für die Bindung des Coenzyms) und eine kleine Domäne (für die Bindung der Untereinheiten) gliedern. Bei Substratbindung bewegt sich die kleine Domäne in Richtung der großen Domäne. Daher ist die Zusammensetzung der Grenzflächen zwischen den Strukturdomainen von Bedeutung; in diesen Regionen finden sich in der Regel hochkonservierte Sequenzen. Unter Verwendung der Struktur einer mutmaßlichen Aminotransferase aus S. pomeroyi als Suchmodell beugten die Kristalle der AspAT bis zu einer Auflösungsgrenze von 2,50 Å (Abb. 1), und die dreidimensionale Struktur wurde mittels Molekularersatzmethode gelöst. Die Analyse der Selbstrotationsfunktion zeigte, dass die vier Moleküle in der asymmetrischen Einheit des Kristalls offenbar eine 222-Molekülsymmetrie aufweisen.

Abbildung 1. Repräsentatives Beugungsbild, aufgenommen bei einem Oszillationsbereich von 1,0 von einem einzelnen AspAT-Kristall.
(Deepak Chandra Saroj, et al. 2014)

Katalytischer Mechanismus

Die Aspartat-Biosynthese ist ein essenzieller Stoffwechselweg, der für Wachstum und Überleben von Mycobacterium tuberculosis erforderlich ist. Die Strukturanalyse der Aspartat-Aminotransferase (AspAT) aus Mtb liefert nicht nur eine Grundlage für das strukturbasierte Design niedermolekularer Inhibitoren, sondern unterstützt auch die Aufklärung des detaillierten katalytischen Mechanismus. Unter physiologischen Bedingungen nutzt AspAT Ketoglutarat und Oxalessigsäure als Amino-Akzeptoren, während Glu und Asp als Amino-Donoren dienen. Es kann mit zwei Substrattypen auf unterschiedliche Weise interagieren. Das wichtigste Coenzym im Reaktionsprozess ist Pyridoxal-5′-phosphat (PLP), dessen ε-4-Kohlenstoffatom kovalent an die Aminogruppe des Lysinrests im aktiven Zentrum bindet und dabei ein Aldimin bildet.

Abbildung 2. Reaktionsmechanismus der Aspartat-Aminotransferase.

AspAT besitzt zwei identische Untereinheiten, und das aktive Zentrum befindet sich an der Grenzfläche der Untereinheiten. Die Aminosäurereste des aktiven Zentrums sind in unterschiedlichen Isoenzymen hochkonserviert. Jede Untereinheit verfügt über eine Bindungsstelle für Substrate und Coenzyme. Das Grundprinzip ist die Wechselwirkung zwischen der Guanidiniumgruppe des Substrats über die positiv geladene Arginin-Seitenkette und der Carboxylgruppe des Substrats. In AspAT interagiert die Carboxylgruppe mit der terminalen Carboxylgruppe. AspAT ist über eine Schiff-Base kovalent an einen Lysinrest gebunden, wobei PIP als Coenzym fungiert. Durch die Umwandlung des Coenzyms zwischen PLP und PMP wird der Transaminierungsprozess gefördert.

Literatur