Cholesterinesterase

Cholesterinesterase (CHE, EC 3.1.1.13) ist ein wichtiges Enzym des Steroidstoffwechsels, das die Hydrolyse von Cholesterinestern zu Cholesterin und Fettsäuren katalysiert. Sie zählt zu den wesentlichen Enzymen für die klinische Bestimmung des Gesamtcholesterins im Serum.

Quellen

Cholesterinesterase kommt in zahlreichen biologischen Geweben vor, darunter Leber, Pankreas, Nebennieren, Gonaden, Brustdrüse, Gehirn und Corpus luteum. Bis in die 1960er-Jahre stammten Cholesterinesterase-Präparate überwiegend aus tierischen Organen; in den letzten Jahren richtet sich das Interesse vieler Forschender jedoch auf die Herstellung von Cholesterinesterase durch Mikroorganismen. Zu diesen Mikroorganismen zählen Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mendocina, Alcaligenes sp., Streptomyces lavendulae, Fusarium oxysporum, Streptomyces sp., Rhodococcus sp. u. a. 1975 reinigten Uwajima et al. erstmals Cholesterinesterase aus Kulturen von fluoreszierenden Pseudomonas. Es ist bekannt, dass Cholesterinesterasen unterschiedlicher Herkunft unterschiedliche Funktionen aufweisen können; derzeit werden insbesondere Cholesterinesterasen aus Pankreas, Leber und aus mikrobiellen Quellen umfassend untersucht und eingesetzt.

Eigenschaften

Die Eigenschaften von Cholesterinesterasen aus unterschiedlichen Quellen unterscheiden sich hinsichtlich Molekülgröße, Struktur, Substratspezifität und Reaktionskinetik. Im Allgemeinen liegt die relative Molekülmasse von CHE im Bereich von 12 kDa bis 60 kDa. Mikrobiell gewonnene, säugetierähnliche CHE weist jedoch eine relativ hohe Molekülmasse (>60 kDa) auf und besteht aus mehr als 500 Aminosäureresten. Die mittels Gelfiltration bestimmte Molekülmasse kann geringfügig höher ausfallen, was möglicherweise auf die Bildung von Cholesterinesterase-Polymeren zurückzuführen ist. Basierend auf Strukturmerkmalen und Aminosäuresequenz kann CHE in zwei Gruppen eingeteilt werden. CHE aus höheren Eukaryoten, Hefen und gramnegativen Bakterien bildet eine Familie, die ein identisches katalytisches Zentrum mit einer GXSXG-Sequenz sowie eine katalytische Triade (Serin/Histidin/Aspartat bzw. Glutamat) aufweist. Der katalytische Mechanismus der CHE-Hydrolyse ähnelt dem der Serinprotease Chymotrypsin. Cholesterinesterasen aus Actinomyceten bilden eine weitere Familie; diese besitzt nicht die typische GXSXG-Sequenz der Carboxylesterasen, weist jedoch drei konservierte Aminosäurereste auf: zwei Serin- und einen Aspartatrest.

Struktur

Die Kristallstruktur der aus Pseudomonas sp. gewonnenen Cholesterinesterase ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Enzym besteht aus zwei identischen Untereinheiten mit einer Molekülmasse von 63 kDa und 534 Aminosäureresten. Charakteristisch für CHE ist, dass es 18 α-Helices, 19 β-Faltblätter und 33 Lysinreste enthält.

Abbildung 1. Kristallstruktur der Cholesterinesterase bei 1,4 Å Auflösung (Pletnev, V. et al. 2002)

Die Cholesterinesterase liegt als Dimer vor, mit vier räumlich getrennten Kontaktbereichen an der Grenzfläche sowie zwei symmetriebezogenen Paaren von Öffnungen zu einer internen intradimeren Kavität. Hydrophobe aktive Zentren (Schluchten) in jeder Untereinheit sind einander über eine zentrale interfaciale Kavität zugewandt. An die Asn314- und Asn351-Reste der CHE-Untereinheiten sind Kohlenhydratketten gebunden; an jeder Stelle sind zwei geordnete N‑Acetyl‑D‑Glucosamin-Einheiten sichtbar.

Aktivitätsbestimmung

In den letzten Jahren wurden Substratspezifität und Reaktionskinetik mikrobiell gewonnener Cholesterinesterasen untersucht. Zwischen CHE aus unterschiedlichen Quellen bestehen Unterschiede, u. a. hinsichtlich pH-Optimum, Temperatur, Stabilität, Substratspezifität und Methodik der Aktivitätsbestimmung. Die Enzymaktivität von CHE wird anhand des bei 500 nm gemessenen Absorptionswerts bestimmt. Die Bestimmung der CHE-Aktivität kann wie folgt durchgeführt werden: 1 mL Lösung A und 500 mL Lösung B werden gemischt, anschließend werden 50 μL einer geeignet verdünnten Enzymlösung zugegeben und die Reaktion wird bei 40 °C exakt 15 min inkubiert. Danach werden 1,4 mL 0,1 mol/L HCl zugegeben, um die Enzymreaktion zu stoppen. Eine Enzymeinheit wurde definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um pro Minute 1 μM Substrat hydrolytisch umzusetzen.

CHE und der menschliche Stoffwechsel

Zahlreiche Studien wurden durchgeführt, um den Zusammenhang zwischen Cholesterinesterase und dem menschlichen Stoffwechsel zu verstehen. Es ist bekannt, dass die pankreatische Cholesterinesterase eine Substratspezifität für Tri-, Di- und Monoacylglyceride sowie Phospholipide aufweist. In der Leber trägt sie zur Aufrechterhaltung des dynamischen Cholesteringleichgewichts bei. Cholesterin liegt im menschlichen Körper in zwei Formen vor: frei und verestert. Berichten zufolge ist CHE in Leberlysosomen, im Zytosol und in Mikrosomen vorhanden. Die lysosomale saure Lipase ist an der Hydrolyse von Lipoproteinen beteiligt, während Cholesterinester und Triacylglyceride zu hepatozellulären Rezeptoren transportiert werden. Es wird angenommen, dass Modifikationen der Cholesterinesterase eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Atherosklerose spielen. Die Details der Aktivierung und Inhibition der Cholesterinesterase sind jedoch weiterhin nicht vollständig geklärt.

Literatur