Cholinoxidase

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Einführung

Cholinoxidase (cholin-oxygen 1-oxidoreduktase) katalysiert die vier-elektronige, zweistufige, flavinvermittelte Oxidation von Cholin zu Glycinbetaine. Im ersten Schritt wird Cholin zu Betainaldehyd oxidiert, und dann wird molekularer Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert. Im zweiten Schritt wird das Betainaldehyd hydratisiert, um gem-Diol-Cholin zu erzeugen, das zu Glycinbetaine oxidiert wird, und Sauerstoff wird zu Wasserstoffperoxid reduziert. Das Enzym wurde erstmals 1948 aus der Rattenleber isoliert, als die Auswirkungen von Stickstoffsenf auf Enzyme und den Gewebestoffwechsel untersucht wurden. Später identifizierten Ikuta et al. 1977 erstmals gereinigte Cholinoxidase aus Arthrobacter globiformis in vitro. Glycinbetaine, das Produkt der Cholinoxidase, ist eines von nur wenigen biokompatiblen Soluten, die von Zellen verwendet werden, um hohen osmotischen Druck auszugleichen. Die Ansammlung großer Mengen Glycinbetaine im Zytoplasma ist für Mikroorganismen entscheidend, da sie den intrazellulären Wassergehalt in den Zellen kontrollieren können. Das Versagen, Glycinbetaine in einer hochsalzigen Umgebung anzusammeln, führt zu Dehydration, osmotischem Schock und Plasmolyse. Viele menschliche Krankheitserreger, darunter E. coli O157:H7, Staphylococcus spp., Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa und Klebsiella pneumoniae, akkumulieren Glycinbetaine, um die hohe Osmolalität am Ort der menschlichen Infektion auszugleichen.

Glycinbetaine ist ein wichtiger Osmoprotektor in der menschlichen Niere und wird auch als Methylspender bei der Biosynthese von Methionin verwendet. Bei Menschen kann Cholin eine Rolle in verschiedenen Stoffwechselwegen spielen, einschließlich der Biosynthese von Lipoproteinen und Phospholipiden sowie der Regulation der Genexpression. Die menschliche Cholin-Dehydrogenase steht in engem Zusammenhang mit einer Vielzahl von Pathologien, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Brustkrebs, männlicher Unfruchtbarkeit, Homocysteinurie und metabolischem Syndrom, usw.

Abbildung 1. Die zweistufige, flavinvermittelte Oxidation von Cholin zu Glycinbetaine, katalysiert von Cholinoxidase (Gadda, G. 2020)

Enzymstruktur

Die Ergebnisse der Größenausschlusschromatographie und der nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestätigten, dass Cholinoxidase in Lösung als konzentrationsunabhängiges Dimer mit einem Molekulargewicht von 120 kDa existiert. Eine Vielzahl von Kristallstrukturen, wie die Kristallstruktur des Wildtyp-Enzyms und mit gebundenem Glycinbetaine sowie mit DMSO im aktiven Zentrum, die Kristallstruktur der aktiven Zentrum-Mutanten S101A im Komplex mit Acetat und die Kristallstruktur von V464A ohne Liganden, bestätigen alle den Dimerzustand des Enzyms. Die Dimeroberfläche besteht aus zwei Sätzen von sechs identischen intersubunitären Kontakten zwischen Resten mit entgegengesetzter Ladung an den Kanten der Oberfläche (Abbildung 2).

Abbildung 2. Dreidimensionale Struktur der Cholinoxidase, verfeinert auf eine Auflösung von 1.86Å (Protein Data Bank 2jbv) (Gadda, G. 2020)

Der zentrale Teil der Dimeroberfläche umfasst eine Reihe von unpolaren Resten, die als Tor fungieren, um den Substrat- und Produktzutritt zu ermöglichen. Der Faltungsmodus jeder Untereinheit der Cholinoxidase ähnelt dem anderer Glukose-Methanol-Cholin-Oxidoreduktasen mit einer PHBH-Faltung. Das Enzym hat eine FAD-bindende Domäne (bestehend aus Resten 1-159, 201-311 und 464-527) und eine Substrat-bindende Domäne (bestehend aus Resten 160-200 und 312-463). Das Flavin ist fest im Protein eingebettet und kovalent an das H99Nε2-Atom über das C8-Methyl gebunden. Im Substrat-bindenden Bereich wird der Boden des aktiven Zentrums von verzerrten sechssträngigen antiparallelen β-Faltblättern gebildet, und auf der anderen Seite ragen drei α-Helices in das Lösungsmittel. Die aktive Zentrumshöhle enthält Reste aus beiden Domänen, E312, W331, H351 und F357 in der Substrat-bindenden Domäne sowie W61, S101, W331, V464, H466 und N510 in der FAD-bindenden Domäne (Abbildung 3).

Abbildung 3. Aktives Zentrum der Wildtyp-Cholinoxidase mit dem Reaktionsprodukt Glycinbetaine gebunden (Gadda, G. 2020)

Substratbindung

Die aktive Zentrumshöhle der Cholinoxidase ist lösungsmittel-exkludiert und liegt angrenzend an die re Fläche des FAD. Das Volumen der Höhle beträgt ~125 ų, was ausreicht, um ein Cholinmolekül (~95 ų) und ein H₂O-Molekül (~30 ų) aufzunehmen. Der Teil der Höhle, der vom Flavin entfernt ist, ist von hydrophoben Resten umgeben (d.h. W61, W331, F357 und V464). Die carboxylische Seitenkette des einzigen negativ geladenen Restes E312 trägt ~15 kJ/mol zur Bindung des Substrats durch die ionische Wechselwirkung mit der Trimethylammonium-Kopfgruppe von Cholin bei. Röntgenkristallographie und Mutagenesestudien haben gezeigt, dass die drei polaren Reste, die die aktive Zentrumshöhle in der Nähe des Isoalloxazin-Teils des FAD begrenzen, nämlich H351, H466 und N510, mit ihren Seitenketten weniger zur Bindung des Substrats beitragen, entweder durch Wasserstoffbrückenbindungen mit der Hydroxylgruppe von Cholin oder durch sterische Effekte.

Abbildung 4. Eingang zum aktiven Zentrum der Cholinoxidase (Gadda, G. 2020)