COX-1

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Einleitung

Die Cyclooxygenase-Isoenzyme COX-1 und COX-2 katalysieren die Bildung von Prostaglandinen, Thromboxan und Levuloglandinen. Prostaglandine sind autakoide Mediatoren, deren reversible Interaktionen mit G‑Protein‑gekoppelten Membranrezeptoren nahezu alle bekannten physiologischen und pathophysiologischen Prozesse beeinflussen können, einschließlich kardiovaskulärer, neuronaler, renaler, immunologischer, gastrointestinaler und reproduktiver Systeme. Levuloglandine stellen eine neuere Produktklasse dar, die offenbar über eine irreversible kovalente Bindung an eine Vielzahl von Proteinen wirkt. COX-Enzyme sind klinisch bedeutsam, da sie durch Acetylsalicylsäure (Aspirin) und viele weitere nichtsteroidale Antirheumatika/Antiphlogistika (NSAR) gehemmt werden; diese Hemmung kann entzündliche, pyretische, thrombotische, neurodegenerative und onkologische Erkrankungen lindern. Etwa hundert Jahre sind vergangen, seit Hoffmann Acetylsalicylsäure (Aspirin) als Wirkstoff konzipierte und synthetisierte, um die gastrointestinale Irritation durch Salicylate zu reduzieren und gleichzeitig die Wirksamkeit zu erhalten.  

Katalytische Mechanismen der Cyclooxygenase

Rund 95 % der Interaktionen betreffen hydrophobe Aminosäurereste. Analysen mittels ortsgerichteter Mutagenese haben den Rest identifiziert, der das proS‑Wasserstoffatom von C‑13 des Arachidonats abstrahiert (Tyr‑385), den Rest, der für die elektrostatische Wechselwirkung mit dem Carboxylat-Anion des Arachidonats verantwortlich ist (Arg 120), sowie die Reste, die die Orientierung des Arachidonats so steuern, dass es optimal zur Bildung von PGG2 angeordnet ist (Val‑349, Trp‑387 und Leu‑534).  Abb. 1 zeigt die Interaktion und die katalytische Reaktion zwischen Arachidonsäure und Aminosäureresten im aktiven Zentrum von COX‑1. Die beiden COX-Isoformen weisen ähnliche Aminosäuresequenzen und katalytische Mechanismen auf. Die Kristallstruktur der murinen Apo‑COX‑2 bestätigte zudem, dass Arachidonsäure im aktiven Zentrum eine katalytisch inkompetente Orientierung einnehmen kann. So kann das anionische Carboxylat-Ende des Substrats Wasserstoffbrücken mit Tyr 385 und Ser 530 bilden, jedoch nicht das erwartete Ionenpaar mit Arg120. Stattdessen kontaktiert Arg 120 das hydrophobe ω‑Ende des Substrats. Im katalytisch aktiven Zustand ähnelt COX‑2 COX‑1, d. h. das Carboxylat-Anion der Arachidonsäure wird durch Arg 120 und Tyr 355 koordiniert, und das C13‑pro(S)‑Wasserstoffatom des Substrats befindet sich in der Nähe von Tyr 385.

Abbildung 1. Aminosäurereste in COX‑1, die die Substratpositionierung und Katalyse steuern (Fitzpatrick, F. 2004)

Bifunktionelle Katalyse in einem einzelnen Enzymprotein: integrierte Wirkungen von Peroxidase und Cyclooxygenase

Von den ersten Berichten über die wichtige Rolle von Radikalen in der COX‑Katalyse bis heute wurden mehrere Erkenntnisse gewonnen. So erzeugen gereinigte COX‑1‑ und COX‑2‑Enzyme, die mit Mangan‑Protoporphyrin IX rekonstituiert und mit Peroxid untersucht wurden, Elektronenspinresonanz‑(EPR‑)Spektren, die eine radikalabhängige Oxidation widerspiegeln. Diese Studie zeigt, dass peroxidgenerierte Radikale in COX‑2 und MnCOX‑1 jeweils dasselbe Arachidonsäure‑Radikal bilden, das anschließend mit Sauerstoff reagiert und Lipidhydroperoxide erzeugt. Die EPR‑Daten deuten ferner darauf hin, dass das metastabile Arachidonat‑Radikal ein planares Pentadienyl‑Radikal enthält, wie vielfach vermutet wurde.

Angesichts der Ähnlichkeiten in Primärsequenzen, Kristallstrukturen und katalytischen Mechanismen ist auch die kompositionelle Regulation der COX‑1‑ und COX‑2‑Katalyse ähnlich, mit nur wenigen Unterschieden. So erfordert die Katalyse der COX‑2‑Isoenzyme eine zehnfach geringere Hydroperoxid-Konzentration als zur Förderung der COX‑1‑Katalyse erforderlich ist. Es wird spekuliert, dass dies auf einen Mechanismus zurückzuführen sein könnte, durch den COX‑2 bevorzugt Prostaglandine (PGs) produziert, wenn beide Isoformen im selben intrazellulären Kompartiment vorhanden sind; weshalb Zellen daraus einen Vorteil ziehen, ist jedoch unklar. Die strukturelle Stabilität von COX‑2 ist sowohl im Bereich des aktiven Zentrums als auch insgesamt in den Untereinheiten geringer als die von COX‑1, was mit unterschiedlichen Präferenzen für Fettsäuresubstrate und Inhibitoren sowie mit der größeren Tasche von COX‑2 zusammenhängen könnte. Ein Valinrest an Position 509 in COX‑2 entspricht dem Isoleucinrest an Position 523 in COX‑1; Mutationsstudien in COX‑1 und COX‑2 legen jedoch nahe, dass der Austausch von Valin und Isoleucin an Position 509/523 nicht alle Unterschiede in der Inhibitorspezifität zwischen den Isoformen vollständig erklärt. Daher könnten Unterschiede in der strukturellen Stabilität zur Ligandenselektivität an den jeweiligen aktiven Zentren der Enzyme beitragen.

Abbildung 2. Einfluss der Acetylierung auf den Substratzugang zu COX‑1 und COX‑2. Spekulativer Effekt der Acylierung auf COX‑2 (Fitzpatrick, F. 2004)