CPO

CPO (EC 1.11.1.10, Chloroperoxidase) gehört zur Klasse der Oxidoreduktasen und ist eine Peroxidase. Der systematische Name dieses Enzyms lautet Chlorid:Wasserstoffperoxid-Oxidoreduktase. Weitere gebräuchliche Bezeichnungen sind Chloroperoxidase, CPO und Vanadium-Haloperoxidase. CPO katalysiert die Chlorierung organischer Verbindungen, wobei die anorganischen Substrate Chlorid und Wasserstoffperoxid zu Cl⁺ umgesetzt werden, das Protonen im Kohlenwasserstoff-Substrat ersetzt. Während der Reaktion nutzt CPO Häm oder Vanadium als Kofaktor. CPO ist ein hämhaltiges Glykoprotein, das vom marinen Pilz Caldariomyces fumago sezerniert wird. Jedes CPO-Molekül enthält eine Ferriprotoporphyrin‑IX‑prosthetische Gruppe, die verschiedene Reaktionen wie Halogenierung, Peroxidation und Epoxidation katalysiert. Über viele Jahre war CPO die einzige Peroxidase, von der bekannt war, dass sie ähnliche spektrale Eigenschaften wie P450 aufweist; inzwischen wurden jedoch ähnliche Enzyme auch in anderen Organismen identifiziert.

Struktur

Das vollständige CPO-Gen kodiert für ein Protein mit 373 Aminosäuren, das durch zwei proteolytische Prozessierungsschritte zur reifen CPO verarbeitet wird: einen am N‑Terminus zur Entfernung eines 20 Aminosäuren langen Signalpeptids sowie einen am C‑Terminus zur Entfernung eines 52 Aminosäuren langen Peptids. Die Tertiärstruktur von CPO enthält zu 50 % Helices, ähnlich wie andere Peroxidasen und P450s, die Gesamt-Topologie ist jedoch nicht identisch mit der anderer Häm-Enzyme. Im Bereich des aktiven Zentrums besteht strukturelle Ähnlichkeit. Wie andere Häm-Peroxidasen faltet CPO in N‑terminale und C‑terminale Domänen, wobei das Häm zwischen beiden Domänen eingebettet ist. Die Faltung umfasst 8 α‑helikale Segmente (A–H), drei kurze 3₁₀-Helices (C', D', G') sowie ein kurzes antiparalleles β‑Paar. Wie andere Häm-Enzyme besitzt CPO eine proximale Helix (Helix A) auf der Häm-Seite, die den axialen Häm-Liganden des Proteins enthält, sowie eine distale Helix (Helix F), die die für die Peroxidaktivierung erforderliche katalytische Gruppe bereitstellt. Bei CPO steht die proximale Helix A senkrecht zur Hämebene, während sie bei Peroxidasen und P450 parallel zur Hämebene verläuft.

Abbildung 1. Struktur von CPO. (Sundaramoorthy M. 1995)

Studien haben gezeigt, dass Cys29 einen thiolierten Häm-Liganden bereitstellt; es handelt sich um den axialen Ligandenrest, der in der N‑terminalen Domäne der CPO lokalisiert ist. Die beiden anderen Cysteine, Cys79 und Cys87, bilden eine Disulfidbrücke. Die drei Proline (Pro9, Pro230 und Pro292) liegen in cis‑Konformation vor, wobei Pro9 eine klassische cis‑Prolin‑Schleife aufweist. Das Polypeptid in den Resten 26–37 umgibt den Cystein-Liganden (Cys29) und bildet ein starres Gerüst für die Interaktion von Eisen und Schwefel. Die Seitenkette von Asn33 und die Rückgrat-Atome von Ala27 bilden ein Paar Wasserstoffbrückenbindungen, während die Seitenketten von Arg26 und Asp37 untereinander Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden.

Abbildung 2. Stereodiagramm der Wasserstoffbrückenbindungs-Interaktionen. (Sundaramoorthy M. 1995)

Katalytischer Mechanismus

Unter allen derzeit bekannten Häm-Peroxidasen katalysiert CPO eine Vielzahl von Reaktionstypen und gilt als das vielseitigste Enzym. Der erste Reaktionstyp ist die Halogenierung unter Verwendung von Wasserstoffperoxid oder einem anderen Hydroperoxid als Initiator, eines Halids (außer Fluorid) sowie einer für die Halogenierungsreaktion empfänglichen Verbindung als Substrat. Der zweite Reaktionstyp ist dem ersten ähnlich, jedoch ist das Substrat Harnsäure. Der dritte Reaktionstyp ist eine Peroxidationsreaktion. CPO kann die Disproportionierung von Wasserstoffperoxid katalysieren, eine katalase-spezifische Reaktion. Darüber hinaus kann CPO auch die P450‑ähnliche Monooxygenierungsreaktion sowie die Dehalogenierung ausgewählter halogenierter aromatischer Verbindungen katalysieren.

Abbildung 3. Von CPO katalysierte Reaktionen. (Poulos T.L. 2014)

Der Ruhezustand der CPO enthält ein Ferrihäm-Zentrum. Die Bindung von Wasserstoffperoxid an das Häm-Eisen initiiert die Reaktion; anschließend werden zwei Elektronen vom Häm-Zentrum auf Wasserstoffperoxid übertragen, was zur Spaltung der Peroxidbindung und zur Bildung von Wassermolekülen sowie des aktivierten Häm-Zwischenprodukts Verbindung I führt. Verbindung I ist ein gemeinsames Zwischenprodukt der meisten durch Häm-Peroxidasen katalysierten Reaktionen. Die chemische Struktur von Verbindung I ist ein Oxo‑Ferryl‑Porphyrin‑Kation‑Radikal [Häm (Fe⁴⁺=O)^•+]. Abhängig von der Proteinmatrix kann Verbindung I des Hämproteins an unterschiedlichen chemischen Reaktionen teilnehmen. In der Katalase-Reaktion interagiert Verbindung I mit einem zweiten Wasserstoffperoxid-Molekül, wodurch Dioxygen gebildet und das Häm-Eisen zu dreiwertigem Eisen reduziert wird. In der Peroxidationsreaktion kann Verbindung I ein organisches Molekül (HA) in ein Radikalprodukt (A•) überführen und durch Übertragung eines Elektrons auf ein organisches Substrat zu Verbindung II reduziert werden. Die Struktur von Verbindung II ist Fe^IV=O. Die Oxidation eines zweiten Substrats kann dreiwertiges Eisen regenerieren. In der Chlorierungsreaktion interagiert Verbindung I mit Chloridionen zur Bildung eines ferrischen Komplexes (Häm Fe³⁺-O-X), der als Verbindung X bezeichnet wird. Dieser ist instabil und zerfällt leicht in den Ruhezustand des Enzyms, ein Halonium-Ion (X⁺) und ein Hydroxidion (OH⁻); diese können weiter zu Hypohalogeniger Säure (HOX) reagieren.

Abbildung 4. Mechanismus der von CPO katalysierten Reaktionen. (Lin J. 2012)

Anwendung

CPO ist eine der vielversprechendsten Häm-Peroxidasen für synthetische Anwendungen. Optisch aktive 2,3‑Epoxyalkohole sind wichtige Bausteine für die Synthese biologisch oder pharmazeutisch relevanter Verbindungen. Die Sharpless‑asymmetrische Epoxidation von allylischen Alkoholen ist eine der vielseitigsten Methoden zur Herstellung optisch aktiver Epoxyalkohole. Die durch CPO katalysierte Epoxidation von Olefinen zeigt eine hohe Enantioselektivität; das Enzym katalysiert jedoch nicht die Epoxidbildung aus allylischen Alkoholen, sondern führt stattdessen zur Bildung von Aldehyden.

Referenzen