Kardiopulmonale Reanimation (CPR)

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Zusammenfassung

Das bi-enzymatische System aus Cytochrom P450 (CYP, ein Hämoprotein) und Cytochrom-P450-Reduktase (CPR, ein Diflavoenzym) nutzt Sauerstoff und NADPH, um in verschiedenen Zellen und Organen die Bildung diverser endogener und xenobiotischer Moleküle zu vermitteln. Bemerkenswerterweise liegt das ubiquitäre Verteilungsverhältnis CYP:CPR, obwohl für den Metabolismus ein 1:1-Verhältnis als optimal angesehen wird, typischerweise bei 10 bis 100:1 oder höher. Darüber hinaus übersteigt die in diesen in vitro- oder in situ-Assemblierungen verbrauchte Menge an NADPH-Äquivalenten häufig deutlich die Menge des metabolisierten Substrats. Es wurde berichtet, dass CPR molekularen Sauerstoff aktivieren und diffusionsfähige reduzierte Sauerstoffspezies (DROS) erzeugen kann. Zudem setzt CPR Peroxid über einen durch diffusionsfähige Radikale vermittelten Prozess um, was zur Bildung von Wasser führt (jedoch ohne signifikante Sauerstofffreisetzung).

Die Forschenden zeigten zudem quantitativ, dass die Sauerstoffaktivierungsrate und die Peroxidabbaurate von CPR die wesentlichen Reaktivitäten in der CYP+CPR-Mischung darstellen. Sie belegen, dass CPR die Konzentration diffusionsfähiger reduzierender Sauerstoffspezies im Reaktionsmilieu modulieren kann. Diese Studien weisen darauf hin, dass CPR, da es DROS zwangsläufig erzeugt und abbaut, in CPR-vermittelten Reaktionen energetisch „ineffiziente“ und potenziell „gefährliche“ Prozesse auftreten müssen. Dies erklärt auch, warum CPR in Zellen in niedriger Dichte vorkommt. Eine Aktivität, die bislang primär dem CYP-Hämzentrum zugeschrieben wurde, wird nun als Facette der Flavine von CPR identifiziert.

Cytochrom P450 und Cytochrom-P450-Reduktase

Cytochrom-P450-Enzyme (CYPs) sind als diverse Familie von Häm-Thiolat-Proteinen für den Metabolismus zahlreicher endogener Moleküle und Xenobiotika in vivo verantwortlich. CYPs wird aufgrund ihrer Fähigkeit, relativ wenig reaktive funktionelle Gruppen selektiv zu oxidieren und chirale Synthone zu erzeugen, ein hohes Potenzial für „Green Chemistry“-Anwendungen zugeschrieben. CYP wirkt dabei im Verbund mit der hochkonservierten Cytochrom-P450-Reduktase (CPR, ein Diflavoenzym). Die terminalen Redoxäquivalente stammen aus reduzierten Nicotinamidadenindinukleotiden (NADPH und NADH), und molekularer Triplett-Sauerstoff dient als Hauptoxidationsmittel. Es wurde festgestellt, dass die gesamte CYP+CPR-Reaktion „entkoppelt“ ist, was zur Bildung diffusionsfähiger reduzierter Sauerstoffspezies (DROS) wie Superoxid und Peroxid im Reaktionssystem führt. Die Substratbindung an das aktive Zentrum von CYP kann das Redoxpotenzial des Häm-Eisens erhöhen, und diese Protein-Protein-Interaktion kann die Reduktion von CYP durch CPR fördern.

Abbildung 1. Früherer Mechanismus für DROS- und Wasserbildung am Hämzentrum (Manoj, K.M.; et al. 2010)

Da die „Entkopplung“ zu einem Verlust von NADPH-Redoxäquivalenten führt, wird dies als energieineffizienter Prozess betrachtet. Theoretisch kann ein Molekül NADPH im Rahmen des gesamten Zwei-Elektronen-Prozesses entweder ein Molekül Peroxid oder ein Molekül eines hydroxylierten Produkts erzeugen. Es liegen jedoch experimentelle Daten vor, die zeigen, dass die verbrauchte NADPH-Menge die Gesamtmenge an hydroxyliertem Produkt und im Reaktionsmedium gebildeten DROS deutlich übersteigt. Zur Erklärung dieses stöchiometrischen Ungleichgewichts wurde ein auf dem Hämzentrum basierender Mechanismus vorgeschlagen, bei dem ein um zwei Elektronen defizientes oxygeniertes CYP-katalytisches Intermediat (Compound I) ein weiteres NADPH-Molekül (unter Mitwirkung von CPR) verbraucht und dadurch Wasser bildet.

Abbildung 2. Die an CYP+CPR-Mischungen beteiligten Reaktionen (Manoj, K.M.; et al. 2010)

Beteiligung von Radikalreaktionen am CPR-vermittelten Abbau von Peroxid

Abbildung 3 zeigt den Effekt der Zugabe von Ascorbinsäurepalmitat (AAP), einem potenten Radikalfänger, auf CPR-vermittelte Peroxidabbau-Reaktionen. Eine Positivkontrollreaktion mit CPR zeigte, dass innerhalb von 40 Minuten mehr als 97 % des initialen Peroxids abgebaut wurden. Die Kontrolle mit AAP allein ergab etwa 35 % Hintergrund-Peroxidabbau, während die Testgruppe mit sowohl CPR als auch AAP im gleichen Zeitraum 47 % Abbau zeigte. Unter Berücksichtigung des autokatalytischen Abbaus von Peroxiden zeigte das AAP-haltige CPR-Reaktionsgemisch nur etwa 19 % der CPR-haltigen Reaktivität. Dieses Ergebnis legt eindeutig nahe, dass der CPR-vermittelte Abbau von Peroxid diffusionsfähige Radikale einbezieht.

Abbildung 3. Der Effekt eines Radikalfängers auf den CPR-vermittelten Peroxidabbau (Manoj, K.M.; et al. 2010)