CPR

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Abstract

Das bi-enzymatische System von Cytochrom P450 (CYP, ein Hämoprotein) und Cytochrom P450 Reduktase (CPR, ein Diflavoenzym) nutzt Sauerstoff und NADPH, um die Produktion verschiedener einheimischer und xenobiotischer Moleküle in verschiedenen Zellen und Organen zu vermitteln. Merkwürdigerweise ist das ubiquitäre Verhältnis von CYP:CPR, obwohl ein Verhältnis von 1:1 als optimal für den Stoffwechsel angesehen wird, 10 bis 100:1 oder höher. Darüber hinaus übersteigen die in diesen in vitro oder in situ Assemblierungen verbrauchten NADPH-Äquivalente oft die Menge des metabolisierten Substrats bei weitem. Es wurde berichtet, dass CPR molekularen Sauerstoff aktivieren und diffusible reduzierte Sauerstoffspezies (DROS) erzeugen kann. Darüber hinaus verbraucht CPR Peroxid durch einen diffusiven radikalvermittelten Prozess, was zur Bildung von Wasser führt (aber ohne signifikante Sauerstoffentwicklung).  

Die Forscher haben auch quantitativ nachgewiesen, dass die Sauerstoffaktivierungsrate und die Peroxidverarmungsrate von CPR die Hauptreaktivitäten in der CYP+CPR-Mischung sind. Sie zeigen, dass CPR die Konzentration von diffusiblen reduzierenden Sauerstoffspezies im Reaktionsmilieu modulieren kann. Diese Studien weisen darauf hin, dass, da CPR unvermeidlich DROS erzeugt und verbraucht, es energetisch „verschwenderisch“ und potenziell „gefährlich“ in CPR-vermittelten Reaktionen sein muss. Dies erklärt auch, warum CPR in Zellen in niedriger Dichte verteilt ist. Einige Aktivitäten, die hauptsächlich dem CYP-Hämzentrum zugeschrieben werden, werden jetzt als Facette der Flavine von CPR identifiziert. 

Cytochrom P450 und Cytochrom P450 Reduktase

Cytochrome P450s (CYPs), als eine vielfältige Familie von Häm-Thiolate-Proteinen, sind verantwortlich für den Stoffwechsel mehrerer einheimischer Moleküle und Xenobiotika in vivo. CYPs gelten als potenziell umweltfreundliche Chemie aufgrund ihrer Fähigkeit, relativ nicht-reaktive Gruppen selektiv zu oxidieren und chirale Synthons zu erzeugen. CYP arbeitet in Zusammenarbeit mit der hochkonservierten Cytochrom P450 Reduktase (CPR, ein Diflavoenzym). Die terminalen Redox-Äquivalente werden aus reduzierten Nicotinamid-Adenin-Dinukleotiden (NADPH und NADH) gewonnen, und molekularer Tripletsauerstoff wird als das Hauptoxidationsmittel verwendet. Die gesamte CYP+CPR-Reaktion wurde als "entkoppelt" befunden, was zur Produktion von diffusiblen reduzierten Sauerstoffspezies (DROS) von Superoxid und Peroxid im Reaktionssystem führt. Die Substratbindung an die aktive Stelle von CYP kann das Redox-Potential des Häm-Eisens erhöhen, und diese Protein-Protein-Interaktion kann die Reduktion von CYP durch CPR fördern.

Abbildung 1. Früher Mechanismus für DROS und Wasserbildung am Hämzentrum (Manoj, K.M.; et al. 2010)

Da "Entkopplung" zu einem Verlust von NADPH-Redox-Äquivalenten führt, wird dies als energieverschwendender Prozess angesehen. Theoretisch kann ein Molekül NADPH ein Molekül Peroxid oder ein Molekül hydroxyliertes Produkt durch den gesamten Zwei-Elektronen-Prozess erzeugen. Es gibt jedoch experimentelle Daten, die zeigen, dass die Menge an verbrauchtem NADPH die gesamte Menge an hydroxyliertem Produkt und DROS, die im Reaktionsmedium gebildet werden, bei weitem übersteigt. Um dieses stöchiometrische Ungleichgewicht zu erklären, wird ein Mechanismus vorgeschlagen, der auf dem Hämzentrum basiert, in dem ein zwei-Elektronen-defizientes, oxygeniertes CYP-katalytisches Intermediat namens Verbindung I ein weiteres NADPH-Molekül (mit Hilfe von CPR) verbraucht und dadurch Wasser produziert.

Abbildung 2. Die Reaktionen, die an CYP+CPR-Mischungen beteiligt sind (Manoj, K.M.; et al. 2010)

Beteiligung von Radikalreaktionen an der CPR-vermittelten Peroxidverarmung

Abbildung 3 zeigt den Effekt der Einbeziehung von Ascorbinsäurepalmitat (AAP), einem starken Radikalfänger, auf die CPR-vermittelten Peroxidabbau-Reaktionen. Eine positive Kontrollreaktion mit CPR zeigte, dass mehr als 97 % des anfänglichen Peroxids innerhalb von 40 Minuten abgebaut wurden. Die Kontrolle mit AAP allein ergab etwa 35 % Hintergrund-Peroxidabbau, während die Testgruppe, die sowohl CPR als auch AAP beinhaltete, über denselben Zeitraum 47 % Abbau ergab. Unter Berücksichtigung des autokatalytischen Abbaus von Peroxiden ergab das AAP-haltige CPR-Reaktionsgemisch nur etwa 19 % der Reaktivität des CPR-haltigen Gemisches. Dieses Ergebnis deutet positiv darauf hin, dass die CPR-vermittelte Peroxidverarmung diffusible Radikale beinhaltet.

Abbildung 3. Der Effekt eines Radikalfängers in der CPR-vermittelten Peroxidverarmung (Manoj, K.M.; et al. 2010)