CRAT

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Einführung

Carnitin-Acyltransferasen sind verantwortlich für den Austausch von Acylgruppen zwischen Carnitin und Coenzym A (CoA). Zu diesen Enzymen gehören Carnitin-Acetyltransferase (CRAT, auch bekannt als CAT), Carnitin-Palmitoyltransferase (CPT) und Carnitin-Octanoyltransferase (COT), die Präferenzen für Substrate von kurzkettigen, mittelkettigen und langkettigen Fettsäuren haben. Diese Enzyme bestehen normalerweise aus etwa 600 Resten mit Molekulargewichten von etwa 70 kDa. Carnitin-Acyltransferasen haben wichtige biologische Funktionen. Zum Beispiel fördern CPT-I und CPT-II den Transport von langkettigen Fettsäuren über die mitochondriale Membran und spielen daher eine entscheidende Rolle in der β-Oxidation von langkettigen Fettsäuren in den Mitochondrien. CRAT könnte am Transport von Acetyl-CoA über die Zellmembran beteiligt sein, um das Verhältnis von Acetyl-CoA zu CoA aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus beteiligt sich CRAT auch am Fortschritt von G1 zur S-Phase des Zellzyklus.

Mutationen oder Störungen dieser Enzyme sind mit vielen schweren und sogar tödlichen menschlichen Krankheiten verbunden. Zum Beispiel können die vererbten rezessiven Defekte von CPT-I und CPT-II zu Hypoketonämie und Hypoglykämie führen, und der CPT-II-Mangel ist die häufigste Ursache für abnormalen Lipidstoffwechsel in der Skelettmuskulatur. Vererbte Defekte in der CRAT-Aktivität können zu schweren Herz- und neurologischen Problemen führen. Bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit zeigt CRAT eine verringerte Aktivität. Daher sind Carnitin-Acyltransferasen vielversprechende Ziele für die Entwicklung therapeutischer Mittel gegen mehrere menschliche Krankheiten geworden. Zum Beispiel sind Inhibitoren von L-CPT-I Isotypen von CPT-I, die hauptsächlich in der Leber und den Nieren exprimiert werden und effektiv nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) behandeln können. Leider ist die klinische Anwendung dieser irreversiblen Inhibitoren aufgrund ihrer Nebenwirkungen stark eingeschränkt. Es gibt keine erkennbare Sequenzhomologie zwischen diesen Enzymen und anderen Proteinen in der Datenbank, was den Prozess für das Design und die Entwicklung neuer und reversibler Inhibitoren von L-CPT-I herausfordernd macht, sodass ein besseres Verständnis der Struktur und Funktion dieser Enzyme erforderlich ist.

Gesamtstruktur von CRAT

Die Kristallstruktur des freien Enzyms von Maus-CRAT bei 1,8 Å Auflösung wurde erhalten. Das atomare Modell enthält 30-625 für jedes der beiden Moleküle in der asymmetrischen Einheit, was im Wesentlichen der vollreifen Form des Enzyms entspricht. Alle Reste außer IIe116 befinden sich in den bevorzugten Regionen des Ramachandran-Diagramms. CRAT besteht aus 16 β-Ketten (β1-β16) und 20 α-Helices (α1-α20), die in zwei Domänen unterteilt werden können. Die C-Domäne enthält ein sechssträngiges gemischtes β-Faltblatt und elf α-Helices. Die Reste in dieser Domäne umfassen die Reste 407-626 am C-Terminus und die Reste 30-95 am N-Terminus des Proteins, und eine Seite des β-Faltblatts in dieser Domäne wird von den α-Helices bedeckt. Die Helix α13, der Bereich der Reste 386-487, bildet eine lange Verbindung zwischen den N- und C-Domänen.

Die N-Domäne enthält ein achtsträngiges gemischtes β-Faltblatt, das auf beiden Seiten von acht α-Helices bedeckt ist. Überraschenderweise teilen sich die N- und C-Domänen sehr ähnliche Polypeptid-Rückgrat-Faltungen, trotz des Fehlens einer erkennbaren Aminosäuresequenzhomologie zwischen ihnen. Diese strukturelle Homologie ist auf den Kern der beiden Domänen beschränkt, einschließlich der sechs β-Stränge in der Mitte des β-Faltblatts und der drei eng verwandten α-Helices (α6, α7 und α12). Insgesamt können 71 Cα-Positionen innerhalb von 3,5 Å zwischen den beiden Domänen überlagert werden, und der quadratische Mittelwert der Abstände für diese äquivalenten Atome beträgt 2,0 Å.

Abbildung 1. Struktur von CRAT (Gerwald, J.; Liang, T. 2003)

Implikationen für den katalytischen Mechanismus: Substrat-unterstützte Katalyse

Das His-Rest im aktiven Zentrum von CRAT fungiert als allgemeine Base in der Katalyse. Je nach Richtung der Reaktion extrahiert es Protonen von der 3-Hydroxylgruppe von Carnitin oder der Thiolgruppe von CoA. Aus dem Mechanismus und der Struktur ist deutlich zu erkennen, dass, wenn nur Acylcarnitin oder Acyl-CoA an das aktive Zentrum bindet, ein Wassermolekül im gegenüberliegenden Kanal des aktiven Zentrums bindet und zum Rezeptor für die Acylgruppe wird. Daher können diese Transferasen auch die einfache Hydrolyse von Acylcarnitin oder Acyl-CoA katalysieren. Diese vergebliche Hydrolyse könnte in vivo keine signifikante Reaktion darstellen, da das aktive Zentrum des Enzyms möglicherweise von seinen beiden Substraten besetzt ist. Strukturelle Analysen und Modellierungsstudien deuten darauf hin, dass die Trimethylammoniumgruppe von Carnitin eine wichtige Rolle in der Katalyse durch diese Acyltransferasen spielen könnte, indem sie das Oxyanion im tetrahedralen Zwischenprodukt der Reaktion stabilisiert. Dies wird durch die Beobachtung unterstützt, dass die positive Ladung von Carnitin für seine Bindung nicht wichtig ist, aber für die katalytische Funktion notwendig ist.

Abbildung 2. Der katalytische Mechanismus der Carnitin-Acyltransferasen (Gerwald, J.; Liang, T. 2003)