CRAT

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Einleitung

Carnitin-Acyltransferasen katalysieren den Austausch von Acylgruppen zwischen Carnitin und Coenzym A (CoA). Zu diesen Enzymen zählen die Carnitin-Acetyltransferase (CRAT, auch als CAT bezeichnet), die Carnitin-Palmitoyltransferase (CPT) und die Carnitin-Octanoyltransferase (COT), die jeweils Substratpräferenzen für kurzkettige, mittelkettige bzw. langkettige Fettsäuren aufweisen. Diese Enzyme umfassen in der Regel etwa 600 Aminosäurereste und haben ein Molekulargewicht von ca. 70 kDa. Carnitin-Acyltransferasen erfüllen wesentliche biologische Funktionen. So fördern CPT-I und CPT-II den Transport langkettiger Fettsäuren über die mitochondriale Membran und spielen damit eine zentrale Rolle in der β‑Oxidation langkettiger Fettsäuren in den Mitochondrien. CRAT kann am Transport von Acetyl‑CoA über die Zellmembran beteiligt sein, um das Gleichgewicht von Acetyl‑CoA zu CoA aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus ist CRAT auch an der Progression vom G1‑ in die S‑Phase des Zellzyklus beteiligt.

Mutationen oder Funktionsstörungen dieser Enzyme stehen im Zusammenhang mit zahlreichen schweren bis potenziell letalen Erkrankungen des Menschen. So können autosomal‑rezessiv vererbte Defekte von CPT‑I und CPT‑II zu Hypoketonämie und Hypoglykämie führen; ein CPT‑II‑Mangel ist die häufigste Ursache eines gestörten Lipidstoffwechsels in der Skelettmuskulatur. Erbliche Defekte der CRAT‑Aktivität können zu schweren kardialen und neurologischen Beeinträchtigungen führen. Bei Patientinnen und Patienten mit Alzheimer‑Erkrankung zeigt CRAT eine verminderte Aktivität. Carnitin-Acyltransferasen sind daher zu vielversprechenden Targets für die Entwicklung therapeutischer Wirkstoffe gegen verschiedene Erkrankungen geworden. Beispielsweise können Inhibitoren von L‑CPT‑I (eine CPT‑I‑Isoform, die überwiegend in Leber und Niere exprimiert wird) zur wirksamen Behandlung des nicht‑insulinabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM) beitragen. Leider ist die klinische Anwendung dieser irreversiblen Inhibitoren aufgrund ihrer Nebenwirkungen stark eingeschränkt. Da zwischen diesen Enzymen und anderen in Datenbanken erfassten Proteinen keine erkennbare Sequenzhomologie besteht, gestaltet sich das rationale Design und die Entwicklung neuer, reversibler Inhibitoren von L‑CPT‑I anspruchsvoll; hierfür ist ein besseres Verständnis von Struktur und Funktion dieser Enzyme erforderlich.

Gesamtstruktur von CRAT

Die Kristallstruktur des freien Enzyms der Maus‑CRAT wurde mit einer Auflösung von 1,8 Å bestimmt. Das Atommodell umfasst für jedes der beiden Moleküle in der asymmetrischen Einheit die Reste 30–625 und entspricht damit im Wesentlichen der vollständigen, reifen Form des Enzyms. Alle Reste mit Ausnahme von Ile116 liegen in den bevorzugten Bereichen des Ramachandran‑Plots. CRAT besteht aus 16 β‑Strängen (β1–β16) und 20 α‑Helices (α1–α20) und lässt sich in zwei Domänen unterteilen. Die C‑Domäne enthält ein sechsträngiges gemischtes β‑Faltblatt und elf α‑Helices. Zu den Resten dieser Domäne gehören die Reste 407–626 am C‑Terminus sowie die Reste 30–95 am N‑Terminus des Proteins; eine Seite des β‑Faltblatts dieser Domäne ist durch die α‑Helices bedeckt. Helix α13, der Bereich der Reste 386–487, bildet eine lange Verbindung zwischen der N‑ und der C‑Domäne.

Die N‑Domäne enthält ein achtsträngiges gemischtes β‑Faltblatt, das auf beiden Seiten von acht α‑Helices bedeckt ist. Überraschenderweise weisen N‑ und C‑Domäne trotz fehlender erkennbarer Aminosäuresequenz‑Homologie sehr ähnliche Faltungen des Polypeptidrückgrats auf. Diese strukturelle Homologie ist auf den Kern beider Domänen beschränkt, einschließlich der sechs β‑Stränge im Zentrum des β‑Faltblatts und der drei eng verwandten α‑Helices (α6, α7 und α12). Insgesamt können 71 Cα‑Positionen zwischen den beiden Domänen innerhalb von 3,5 Å überlagert werden; die mittlere quadratische Abweichung (RMSD) dieser äquivalenten Atome beträgt 2,0 Å.

Abbildung 1. Struktur von CRAT (Gerwald, J.; Liang, T. 2003)

Implikationen für den katalytischen Mechanismus: substratassistierte Katalyse

Der His‑Rest im aktiven Zentrum von CRAT fungiert in der Katalyse als allgemeine Base. Abhängig von der Reaktionsrichtung abstrahiert er Protonen entweder von der 3‑Hydroxylgruppe des Carnitins oder von der Thiolgruppe von CoA. Aus Mechanismus und Struktur ist klar ersichtlich, dass bei Bindung ausschließlich von Acylcarnitin oder Acyl‑CoA an das aktive Zentrum ein Wassermolekül im gegenüberliegenden Kanal des aktiven Zentrums bindet und als Akzeptor der Acylgruppe fungiert. Daher können diese Transferasen auch die einfache Hydrolyse von Acylcarnitin oder Acyl‑CoA katalysieren. Diese unproduktive Hydrolyse ist in vivo möglicherweise nicht von wesentlicher Bedeutung, da das aktive Zentrum des Enzyms durch seine beiden Substrate besetzt sein kann. Strukturanalysen und Modellierungsstudien deuten darauf hin, dass die Trimethylammoniumgruppe des Carnitins eine wichtige Rolle in der Katalyse dieser Acyltransferasen spielen könnte, indem sie das Oxyanion im tetraedrischen Zwischenprodukt der Reaktion stabilisiert. Dies wird durch die Beobachtung gestützt, dass die positive Ladung des Carnitins für dessen Bindung nicht entscheidend ist, jedoch für die katalytische Funktion erforderlich ist.

Abbildung 2. Der katalytische Mechanismus der Carnitin-Acyltransferasen (Gerwald, J.; Liang, T. 2003)