CS

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Abstract

Die stereochemische Natur der enzymatischen Kondensationsreaktion besteht darin, dass die Acetylgruppe von Acetyl-Coenzym A an die si-Seite der Keto-Gruppe von Oxalacetat mit Inversion der Methylgruppe angefügt wird.

Die gesamte Reaktion kann in drei chemische Reaktionen unterteilt werden: (a) Enolisation der Thioestergruppe von Acetyl-Coenzym A durch Protonabstraktion von der Acetylgruppe zur Bildung eines Enolat-Anions; (b) Kondensation des Enolat-Anions mit der Carboxylgruppe von Oxalacetat zur Bildung eines Citryl-Thioesters; (c) das Citrat-Thioester wird hydrolysiert, um Citrat und Coenzym A zu bilden. Die Gesamtreaktion hat eine Umsatzrate von etwa 6000 mol s^-1 pro aktiver Stelle und eine scheinbare Gleichgewichtskonstante von 8380 Liter mol^-1 bei pH 7,2. Oxalacetat bindet zuerst, und die Bindungskonstante von Acetyl-Coenzym A steigt um mindestens das 20-Fache. Wenn Acetyl-Coenzym A zuerst binden darf, wird die Bindungsrate von Oxalacetat verringert. Citratsynthase (CS) ist hochspezifisch und unterliegt nur Kondensationsreaktionen, wenn ihre physiologischen Substrate Oxalacetat und Acetyl-Coenzym A sind. In der Lyase-Reaktion (der Umkehrung der Kondensationsreaktion) wird nur die Citrullin-Gruppe von Citrullin-Coenzym A gespalten. Nur Citryl- oder Malyl-Coenzym A kann von diesem Enzym hydrolysiert werden. Aus den Sequenzen, die für die Enzyme aus dem Schweineherz und E. coli erhalten wurden, ist bekannt, dass das Enzym aus dem Schweineherz aus zwei identischen Untereinheiten von 437 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 48.969 besteht. Jede Untereinheit hat eine aktive Stelle, die eine Bindungsstelle für Oxalacetat und Acetyl-CoA enthält, und diese aktiven Stellen scheinen funktionell unabhängig voneinander zu sein.    

Molekulare Struktur

Die Strukturen für drei Kristallformen (Raumgruppen P 4₁2₁2, C2 und P 4₃2₁2), die die folgenden Enzym-Ligand-Komplexe enthalten, wurden bestimmt:

Die Dimer-Moleküle in allen Kristallformen, mit Ausnahme der Kristalle, die Oxalacetat und S-Acetonyl-Coenzym A enthalten, gehorchen einer exakten zweifachen Symmetriebeziehung. In Oxalacetat-gebundenen Kristallen ist das Dimer eine asymmetrische Einheit und die Untereinheiten sind durch ein lokales Diad verbunden. Die Struktur der Citratsynthase variiert stark zwischen den drei Kristallformen. Das Molekül hat eine "offene" und zwei "geschlossene" Konformationen. Die beiden geschlossenen Konformationen sehen auf der Oberfläche ähnlich aus, aber die Packung der inneren Seitenketten ist etwas unterschiedlich.

Abbildung 1. (a) Raumfüllende Darstellung des offenen Dimer der Citratsynthase. (b) Raumfüllende Darstellung beider geschlossenen Formen des Dimer. Der Blickwinkel ist entlang der zweifachen Achse (Wiegand, G.; Remington, S.J. 1986)

Citrat/Oxalacetat-Bindungsstelle

Die aktive Stelle befindet sich in der Spalte zwischen den beiden Domänen der Untereinheit. Bindungsstellen für Citrat oder Oxalacetat und Coenzym A sind in der geschlossenen Form des Enzyms zu beobachten. In der C2-Kristallform bindet Citrat tief in der Spalte zwischen den großen und kleinen Domänen und ist aufgrund der Anwesenheit von Coenzym A vollständig unzugänglich für das Lösungsmittel. Das Citrat-Molekül ist durch Wasserstoffbrücken oder Salzbrücken mit drei Histidin-Resten (His 174, His 238 und His 320) und drei Arginin-Resten (Arg 329, Arg 401 und Arg 421 von der anderen Untereinheit) verbunden. Die aktive Stelle ist überwiegend polar, aber unpolare Wechselwirkungen können dazu beitragen, die extreme Substratspezifität der Citratsynthase zu bestimmen und als Auslöser für konformationale Änderungen zu wirken, zum Beispiel bildet Phe 397 eine ungewöhnliche Kanteninteraktion mit dem Citrat-Molekül. Die aktive Stelle kann Oxalacetat genauso aufnehmen wie Citrat. Die Achsen der Helices K und L zeigen auf gebundene Citrate mit entgegengesetzten Polaritäten, sodass ihre elektrischen Felder zur Citratbindung und Polarisation beitragen können.

Abbildung 2. Stereozeichnung der Citrat-Bindungsstelle im monoklinen Modell (Wiegand, G.; Remington, S.J. 1986)

1. citrate synthase from pig heart muscle with no ligands,
2. citrate synthase from pig heart muscle with no ligands,
3. pig heart citrate synthase with bound citrate and Coenzyme A,
4. pig heart citrate synthase with bound oxaloacetate and S-acetonyl Coenzyme A,
5. chicken heart muscle citrate synthase with bound citrate and Coenzyme A, and
6. chicken heart citrate synthase with bound (3R, S)-3, 4 dicarboxy-3-hydroxybutyl-Coenzyme A (a citryl-Coenzyme A analog).