CS

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Zusammenfassung

Die stereochemische Natur der enzymatischen Kondensationsreaktion besteht darin, dass die Acetylgruppe von Acetyl‑Coenzym A an die si‑Fläche der Keto‑Funktion von Oxalacetat addiert wird, wobei die Methylgruppe eine Inversion erfährt.

Die Gesamtreaktion lässt sich in drei chemische Teilschritte untergliedern: (a) Enolisierung der Thioestergruppe von Acetyl‑Coenzym A durch γ‑Protonenabstraktion aus der Acetyl‑Einheit unter Bildung eines Enolat‑Anions; (b) Kondensation des Enolat‑Anions mit der Carboxylgruppe von Oxalacetat zur Bildung eines Citryl‑Thioesters; (c) Hydrolyse des Citrat‑Thioesters zur Bildung von Citrat und Coenzym A. Die Gesamtreaktion weist eine Umsatzzahl von etwa 6000 mol s^-1 pro aktivem Zentrum sowie eine apparente Gleichgewichtskonstante von 8380 Liter mol^-1 bei pH 7,2 auf. Oxalacetat bindet zuerst, wodurch die Bindungskonstante von Acetyl‑Coenzym A um mindestens das 20‑Fache ansteigt. Wenn Acetyl‑Coenzym A zuerst binden darf, ist die Bindungsrate von Oxalacetat reduziert. Die Citrat‑Synthase (CS) ist hochspezifisch und katalysiert Kondensationsreaktionen ausschließlich, wenn die physiologischen Substrate Oxalacetat und Acetyl‑Coenzym A vorliegen. In der Lyase‑Reaktion (der Umkehrreaktion der Kondensation) wird ausschließlich die Citrullyl‑Einheit von Citrullyl‑Coenzym A gespalten. Nur Citryl‑ oder Malyl‑Coenzym A kann durch dieses Enzym hydrolysiert werden. Aus den Sequenzen der Enzyme aus Schweineherz und E. coli ist bekannt, dass das Schweineherz‑Enzym aus zwei identischen Untereinheiten mit jeweils 437 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 48.969 besteht. Jede Untereinheit besitzt ein aktives Zentrum mit einer Bindungsstelle für Oxalacetat und Acetyl‑CoA; diese aktiven Zentren scheinen funktionell unabhängig voneinander zu sein.    

Molekulare Struktur

Die Strukturen von drei Kristallformen (Raumgruppen P 4₁2₁2, C2 und P 4₃2₁2), die die folgenden Enzym‑Ligand‑Komplexe enthalten, wurden bestimmt:

Die Dimer‑Moleküle in allen Kristallformen – mit Ausnahme der Kristalle, die Oxalacetat und S‑Acetonyl‑Coenzym A enthalten – folgen einer exakten zweizähligen Symmetriebeziehung. In Oxalacetat‑gebundenen Kristallen ist das Dimer eine asymmetrische Einheit, und die Untereinheiten sind durch eine lokale Diade miteinander verknüpft. Die Struktur der Citrat‑Synthase variiert deutlich zwischen den drei Kristallformen. Das Molekül weist eine „offene“ und zwei „geschlossene“ Konformationen auf. Die beiden geschlossenen Konformationen erscheinen an der Oberfläche ähnlich, jedoch unterscheidet sich die Packung der inneren Seitenketten teilweise.

Abbildung 1. (a) Raumfüllende Darstellung des Dimers der offenen Form der Citrat‑Synthase. (b) Raumfüllende Darstellung beider geschlossenen Formen des Dimers. Blickrichtung entlang der zweizähligen Achse (Wiegand, G.; Remington, S.J. 1986)

Citrat-/Oxalacetat‑Bindungsstelle

Das aktive Zentrum befindet sich in der Spalte zwischen den beiden Domänen der Untereinheit. Bindungsstellen für Citrat bzw. Oxalacetat und Coenzym A werden in der geschlossenen Form des Enzyms beobachtet. In der C2‑Kristallform bindet Citrat tief in der Spalte zwischen der großen und der kleinen Domäne und ist aufgrund der Anwesenheit von Coenzym A vollständig für das Lösungsmittel unzugänglich. Das Citrat‑Molekül ist über Wasserstoffbrückenbindungen bzw. Salzbrücken mit drei Histidinresten (His 174, His 238 und His 320) und drei Argininresten (Arg 329, Arg 401 und Arg 421 aus der anderen Untereinheit) verknüpft. Das aktive Zentrum ist überwiegend polar; nichtpolare Wechselwirkungen können jedoch zur Ausprägung der extremen Substratspezifität der Citrat‑Synthase beitragen und als Auslöser für Konformationsänderungen wirken; so bildet beispielsweise Phe 397 eine ungewöhnliche Kanten‑auf‑Interaktion („edge‑on“) mit dem Citrat‑Molekül. Das aktive Zentrum kann Oxalacetat in ähnlicher Weise wie Citrat aufnehmen. Die Achsen der Helices K und L sind mit entgegengesetzter Polarität auf gebundene Citrate ausgerichtet, sodass ihre elektrischen Felder zur Citratbindung und Polarisierung beitragen können.

Abbildung 2. Stereodarstellung der Citrat‑Bindungsstelle im monoklinen Modell (Wiegand, G.; Remington, S.J. 1986)

1. citrate synthase from pig heart muscle with no ligands,
2. citrate synthase from pig heart muscle with no ligands,
3. pig heart citrate synthase with bound citrate and Coenzyme A,
4. pig heart citrate synthase with bound oxaloacetate and S-acetonyl Coenzyme A,
5. chicken heart muscle citrate synthase with bound citrate and Coenzyme A, and
6. chicken heart citrate synthase with bound (3R, S)-3, 4 dicarboxy-3-hydroxybutyl-Coenzyme A (a citryl-Coenzyme A analog).