DAAO

D-Aminosäureoxidase (DAAO, EC 1.4.3.3) ist eine typische Protease, die auf Flavin-Adenin (FDA) basiert. Das Enzym hat eine hohe stereoisomere Selektivität und ein breites Spektrum an katalytischen Substraten und kann weitreichend für die qualitative und quantitative Analyse von D-Aminosäuren, Biosensoren, die Produktion von L-Aminosäuren und α-Ketosäuren verwendet werden. Der wichtigere Wert von DAAO ist jedoch die Anwendung eines zweistufigen Verfahrens zur Produktion von 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA). Die Oxidation von Cephalosporin C mit D-Aminosäureoxidase (DAAO) zur Produktion von Glutaryl-7-Aminocephalosporansäure (GL-7-ACA), gefolgt von der Deacetylierung durch GL-7-ACA-Acylase zur Produktion von 7-ACA. In den letzten Jahren hat die zweistufige enzymatische Umwandlung von Cephalosporin (CPC) zur biokatalytischen Produktion von 7-ACA zunehmend Aufmerksamkeit erregt.

Verteilung

DAAO ist weit verbreitet in Leber-, Gehirn- und Nierengeweben von Säugetieren wie Menschen, Ratten, Kaninchen und Schweinen zu finden. DAAO ist auch weit verbreitet in Mikroorganismen wie Algen, Neurospora, Aspergillus, Bakterien, Trichoderma morphicum, Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutin. Die Sequenzanalyse von D-Aminosäureoxidase aus verschiedenen Quellen zeigt, dass es einen Grad an Homologie zwischen ihnen gibt. Je näher die Arten verwandt sind, desto höher ist die Homologie, aber es gibt signifikante Unterschiede in den biochemischen Eigenschaften.

Zum Beispiel ist die Bindung der D-Aminosäureoxidase von Säugetieren an das prosthetische FAD locker, und die prosthetische Gruppe geht leicht verloren, wodurch die DAAO ihre Lebensfähigkeit verliert. In Bezug auf die Substratnutzung ist die oxidative Deaminierungsaktivität von Cephalosporin C durch DAAO aus tierischen Quellen relativ niedrig, während DAAO, die von einigen Hefen produziert wird, eine starke Bindung an FAD und eine hohe katalytische Aktivität gegenüber CPC-Seitenketten aufweist.

Physiologische Funktion

Mikroorganismen, insbesondere Hefen, können unter Verwendung von D-Aminosäureoxidase gezüchtet werden. Darüber hinaus spielen D-Aminosäuren auch eine wichtige Rolle bei der Bildung von bakteriellen Zellwänden. Sie sind Bestandteile von Peptidoglykanen und Muraminsäuren, aber es gibt nur wenige Studien zur Produktion von D-Aminosäuren in Tieren, und die meisten konzentrieren sich auf Wirbeltiere. Daher ist die physiologische Rolle von DAAO in höheren Tieren noch nicht klar. D'Aniello et al. glauben, dass DAAO und D-Aspartatoxidase (DAS-PO) im Körper einiger Tiere exogene D-Aminosäuren metabolisieren können, während sie als Antidot für endogene D-Aminosäuren wirken. Neuere Studien haben bestätigt, dass D-Aminosäuren eine Rolle bei der Nervenleitung im Gehirn spielen und dass DAAO für die Kontrolle des Gehalts an D-Aminosäuren im Gehirn verantwortlich ist.

Biologische Eigenschaften

Im Jahr 1973 wurde die D-Aminosäureoxidase aus Schweine-Nieren (pKDAAO) als erstes gereinigtes Flavoprotein extrahiert. Die komplementäre DNA (cDNA) von pKDAAO wurde vollständig kloniert und sequenziert. pKDAAO enthält einen offenen Leserahmen von 1041 Basenpaaren, der 347 Aminosäuren des Enzyms kodiert. Die gereinigte D-Aminosäureoxidase (RgDAAO) wurde 1987 in Rhodotorula chinensis erhalten, was ebenfalls die erste Reinigung eines Flavoproteins aus Mikroorganismen war. Die cDNA von RgDAAO wurde durch PCR kloniert und das Holoenzym wurde ebenfalls in E. coli hergestellt. Im Jahr 1998 wurde das Genom von RgDAAO sequenziert, und die gesamte protein-kodierende Region enthielt 1104 Basenpaare, und es wurde bestätigt, dass es 5 Introns enthielt. Dann wurde auch die D-Aminosäureoxidase von Trigonopsos variabilis (TvDAAO) isoliert. Das Gen wurde kloniert und es wurde festgestellt, dass das Holoenzym 356 Aminosäuren enthielt und ein Intron im Genom von TvDAAO vorhanden war.

Katalytischer Mechanismus

Die D-Aminosäureoxidase oxidiert die Aminogruppe der D-Aminosäure, um die entsprechende Ketosäure und Ammoniak zu bilden. Diese Reaktion muss mit der Beteiligung von FAD durchgeführt werden. Der Reaktionsprozess ist in drei Schritte unterteilt:

(1) RCHNH₂COOH + E-FAD → RC=NHCOOH + E-FADH₂
(2) E-FADH₂ + O₂ → E-FAD + H₂O₂
(3) RC=NHCOOH + H₂O → RCOCOOH + NH₃

Reaktion (1) ist eine unvollständige Reduktionsreaktion, und die D-Aminosäure deoxygeniert zu der entsprechenden Iminosäure und bindet an das reduzierte FAD. Dieser Schritt ist die einzige enzymatische Reaktion in der gesamten Reaktion. In Reaktion (2) wird das reduzierte FAD in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff erneut oxidiert und Sauerstoff wird in Wasserstoffperoxid umgewandelt. In Reaktion (3) wird die Iminosäure ohne ein Enzym zu α-Ketosäure und Ammoniak hydrolysiert. Wenn jedoch Wasserstoffperoxid im Körper vorhanden ist, erfolgt eine Decarboxylierung der α-Ketosäure, um die entsprechende Säure zu produzieren.

Anwendungen

Derzeit wird D-Aminosäureoxidase hauptsächlich in der zweistufigen enzymatischen Produktion von 7-Aminocephalosporansäure verwendet. Die Umwandlung von CPC zu 7-ACA durch die zweistufige enzymatische Reaktion ist wie folgt: Im ersten Schritt katalysiert die D-Aminosäureoxidase die oxidative Deaminierungsreaktion der D-Aminoadipoyl-Seitenkette im CPC-Molekül unter aeroben Bedingungen, um α-Ketosäure-Adipoyl-7-Aminocephalosporansäure (AKA-7-ACA), NH₃ und H₂O₂ zu erzeugen. Das erzeugte H₂O₂ oxidiert wiederum AKA-7-ACA weiter und decarboxyliert es zu Glutaryl-7-Aminocephalosporansäure (GL-7-ACA). Dann wurde die Glutaryl-Seitenkette von GL-7-ACA durch die Wirkung von GL-7-ACA-Acylase hydrolysiert, um das Endprodukt 7-ACA der zweistufigen Reaktion zu bilden. Mit molekularbiologischen Methoden wurde das DAAO-Gen kloniert, exprimiert und in der industriellen Produktion verwendet. Es wird gehofft, dass es als D-Aminosäure-Antidot in der Lebensmittelindustrie eingesetzt werden kann.