DAAO

D‑Aminosäureoxidase (DAAO, EC 1.4.3.3) ist ein typisches Flavoprotein auf Basis von Flavinadenindinukleotid (FAD). Das Enzym weist eine hohe Stereoselektivität sowie ein breites katalytisches Substratspektrum auf und kann breit für die qualitative und quantitative Analyse von D‑Aminosäuren, für Biosensoren sowie zur Herstellung von L‑Aminosäuren und α‑Ketosäuren eingesetzt werden. Von besonderer Bedeutung ist jedoch die Anwendung von DAAO in einem zweistufigen Prozess zur Herstellung von 7‑Aminocephalosporansäure (7‑ACA). Dabei wird Cephalosporin C zunächst durch D‑Aminosäureoxidase (DAAO) oxidiert, wodurch Glutaryl‑7‑Aminocephalosporansäure (GL‑7‑ACA) entsteht; anschließend erfolgt die Deacylierung durch GL‑7‑ACA‑Acylase zur Bildung von 7‑ACA. In den letzten Jahren hat die zweistufige enzymatische Umwandlung von Cephalosporin C (CPC) zur biokatalytischen Herstellung von 7‑ACA zunehmende Aufmerksamkeit erlangt.

Verbreitung

DAAO kommt in Leber‑, Gehirn‑ und Nierengewebe von Säugetieren wie Mensch, Ratte, Kaninchen und Schwein weit verbreitet vor. DAAO ist zudem in Mikroorganismen wie Algen, Neurospora, Aspergillus, Bakterien, Trichoderma morphicum, Saccharomyces cerevisiae und Rhodotorula glutin verbreitet. Sequenzanalysen von D‑Aminosäureoxidasen unterschiedlicher Herkunft zeigen einen gewissen Grad an Homologie. Je näher die Arten verwandt sind, desto höher ist die Homologie; zugleich bestehen jedoch deutliche Unterschiede in den biochemischen Eigenschaften.

So ist beispielsweise die Bindung der D‑Aminosäureoxidase von Säugetieren an die prosthetische FAD‑Gruppe relativ locker; die prosthetische Gruppe kann leicht verloren gehen, wodurch DAAO seine Aktivität einbüßt. Hinsichtlich der Substratverwertung ist die oxidative Desaminierungsaktivität gegenüber Cephalosporin C bei DAAO aus tierischen Quellen vergleichsweise gering, während DAAO aus einigen Hefen eine starke FAD‑Bindung sowie eine hohe katalytische Aktivität gegenüber den CPC‑Seitenketten aufweist.

Physiologische Funktion

Mikroorganismen, insbesondere Hefen, können unter Nutzung von D‑Aminosäureoxidasen kultiviert werden. Darüber hinaus spielen D‑Aminosäuren eine wichtige Rolle bei der Bildung bakterieller Zellwände. Sie sind Bestandteile von Peptidoglykanen und Muraminsäuren; zur Bildung von D‑Aminosäuren in Tieren liegen hingegen nur wenige Studien vor, die sich überwiegend auf Wirbeltiere konzentrieren. Daher ist die physiologische Rolle von DAAO in höheren Tieren bislang nicht eindeutig geklärt. D’Aniello et al. gehen davon aus, dass in einigen Tieren DAAO und D‑Aspartatoxidase (DAS‑PO) im Organismus exogene D‑Aminosäuren metabolisieren und zugleich als „Entgiftungssystem“ für endogene D‑Aminosäuren wirken. Neuere Untersuchungen haben bestätigt, dass D‑Aminosäuren eine Rolle bei der neuronalen Signalübertragung im Gehirn spielen und dass DAAO für die Regulation des D‑Aminosäuregehalts im Gehirn verantwortlich ist.

Biologische Eigenschaften

1973 war die D‑Aminosäureoxidase aus Schweineniere (pKDAAO) das erste gereinigte, extrahierte Flavoprotein. Die komplementäre DNA (cDNA) von pKDAAO wurde vollständig kloniert und sequenziert. pKDAAO enthält einen offenen Leserahmen von 1041 Basenpaaren, der für 347 Aminosäuren des Enzyms kodiert. 1987 wurde in Rhodotorula chinensis gereinigte D‑Aminosäureoxidase (RgDAAO) gewonnen; dies war zugleich die erste Reinigung eines Flavoproteins aus Mikroorganismen. Die cDNA von RgDAAO wurde mittels PCR kloniert, und das Holoenzym wurde ebenfalls in E. coli exprimiert. 1998 wurde das RgDAAO‑Genom sequenziert; die gesamte proteinkodierende Region umfasste 1104 Basenpaare, und es wurde bestätigt, dass sie 5 Introns enthält. Anschließend wurde auch die D‑Aminosäureoxidase aus Trigonopsos variabilis (TvDAAO) isoliert. Das Gen wurde kloniert, und es zeigte sich, dass das Holoenzym 356 Aminosäuren umfasst und im Genom von TvDAAO ein Intron enthält.

Katalytischer Mechanismus

Die D‑Aminosäureoxidase oxidiert die Aminogruppe der D‑Aminosäure und bildet dabei die entsprechende Ketosäure sowie Ammoniak. Diese Reaktion erfolgt unter Beteiligung von FAD. Der Reaktionsablauf gliedert sich in drei Schritte:

(1) RCHNH₂COOH + E‑FAD → RC=NHCOOH + E‑FADH₂
(2) E‑FADH₂ + O₂ → E‑FAD + H₂O₂
(3) RC=NHCOOH + H₂O → RCOCOOH + NH₃

Reaktion (1) ist eine unvollständige Reduktionsreaktion, bei der die D‑Aminosäure zu der entsprechenden Iminosäure dehydrogeniert wird und an das reduzierte FAD bindet. Dieser Schritt ist die einzige enzymkatalysierte Reaktion im gesamten Ablauf. In Reaktion (2) wird das reduzierte FAD in Gegenwart von molekularem Sauerstoff erneut oxidiert, wobei Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid umgesetzt wird. In Reaktion (3) wird die Iminosäure ohne Enzym zu α‑Ketosäure und Ammoniak hydrolysiert. Liegt jedoch Wasserstoffperoxid im Organismus vor, kann es zur oxidativen Decarboxylierung der α‑Ketosäure kommen, wodurch die entsprechende Säure entsteht.

Anwendungen

Derzeit wird D‑Aminosäureoxidase hauptsächlich in der zweistufigen enzymatischen Herstellung von 7‑Aminocephalosporansäure eingesetzt. Die Umwandlung von CPC zu 7‑ACA mittels zweistufiger enzymatischer Reaktion verläuft wie folgt: Im ersten Schritt katalysiert D‑Aminosäureoxidase unter aeroben Bedingungen die oxidative Desaminierung der D‑Aminoadipoyl‑Seitenkette im CPC‑Molekül, wobei α‑Ketosäure‑Adipoyl‑7‑Aminocephalosporansäure (AKA‑7‑ACA), NH₃ und H₂O₂ entstehen. Das gebildete H₂O₂ bewirkt anschließend eine weitere oxidative Decarboxylierung von AKA‑7‑ACA zu Glutaryl‑7‑Aminocephalosporansäure (GL‑7‑ACA). Danach wird die Glutaryl‑Seitenkette von GL‑7‑ACA durch die Wirkung der GL‑7‑ACA‑Acylase hydrolysiert, wodurch das Endprodukt 7‑ACA der zweistufigen Reaktion entsteht. Mittels molekularbiologischer Methoden wurde das DAAO‑Gen kloniert, exprimiert und in der industriellen Produktion eingesetzt. Es wird erwartet, dass es als „Antidot“ gegen D‑Aminosäuren auch in der Lebensmittelindustrie Anwendung finden kann.