DERA

Verwandte Lektüre

Einleitung

2-Desoxy-D-ribose-5-phosphat-Aldolase (DERA) katalysiert die reversible Aldolreaktion von Acetaldehyd und Glycerinaldehyd-3-phosphat (G3P) zur Bildung von 2-Desoxyribose-5-phosphat (DR5P). Dieses Enzym nimmt unter den Aldolasen eine Sonderstellung ein, da es als natürlichen Donor ein Aldehyd und nicht ein Keton nutzt. Alle bislang bekannten DERAs arbeiten nach dem Klasse‑I‑Mechanismus. DERA kann zahlreiche Aldehyde mit längeren Ketten von bis zu vier Kohlenstoffatomen akzeptieren und in G3P ein stereogenes Zentrum mit (S)-Konfiguration erzeugen. Ein weiteres interessantes Merkmal von DERA ist die Fähigkeit, eine sequenzielle Aldolreaktion zu katalysieren und dabei 2,4,6-Tridesoxyhexosen zu bilden, die als wertvolles Zwischenprodukt für Atorvastatin und cholesterinsenkende Arzneimittel eingesetzt werden können. Es wurde festgestellt, dass die sequenzielle Addition von zwei Molekülen Acetaldehyd und Chloroacetaldehyd zu einem hoch stereospezifischen Polyolsystem führen kann, bei dem die Stereoselektivität durch das Enzym und nicht durch das Substrat gesteuert wird. Diese sequenzielle Aldolreaktion ist thermodynamisch kontrolliert und stoppt, sobald ein stabiles intramolekulares Halbacetal gebildet wird. 

Abbildung 1. Die in vivo durch DERA katalysierte 2-Desoxy-D-ribose-5-phosphat-Reaktion (Haridas, M.; et al. 2018)

DERA wird durch das deoC-Gen kodiert. Die Sequenz von DERA_EC wurde erstmals 1982 beschrieben, als das Enzym aus dem E.-coli-Stamm K‑12 isoliert wurde. Das Enzym besteht aus 259 Aminosäuren und hat eine Molekülmasse von 27,7 kDa. Die Aminosäurezusammensetzung des aus S. typhimurium isolierten Enzyms ist seit Langem beschrieben. In den letzten Jahren wurde DERA in einer Vielzahl pflanzlicher und tierischer Gewebe identifiziert, und diese Gewebe wurden anhand mehrerer Parameter charakterisiert. Beim Menschen ist es am stärksten in Lungen- und Leberzellen exprimiert und beteiligt sich an der Stressantwort, indem es stressinduzierte Schäden in diesen Zellen verzögert oder minimiert.

Die Röntgenstruktur von DERA_EC zeigt, dass das Enzym die typische TIM-(α/β)₈-Fass-Faltung aufweist. Strukturanalysen zufolge liegt das Enzym als Dimer vor. Nach dem Vergleich der Kristallstrukturen von DERA aus unterschiedlichen Organismen wurde festgestellt, dass Wassermoleküle in allen Kristallstrukturen konserviert sind, was auf ihre Bedeutung für den katalytischen Mechanismus hinweist. Strukturelle Untersuchungen des aus dem Archaeon Aeropyrum pernix isolierten Enzyms zeigen, dass dessen Monomerstruktur der von DERA_EC sehr ähnlich ist, es jedoch in einer stabilen Tetramerstruktur vorliegt. Die Tetramerform spielt eine wichtige Rolle bei der Erhöhung der thermischen Stabilität des Proteins, hat jedoch keinen Einfluss auf die katalytische Aktivität.

Spätere kristallographische Studien identifizierten ein Carbinolamin-Zwischenprodukt sowie einen zweiten Lysinrest an Position 201 (Lys), der sich in unmittelbarer Nähe zu Lys167 befindet. Nachfolgende Untersuchungen zeigten, dass Lys167 und Lys201 für die katalytische Aktivität von DERA entscheidend sind: Lys167 ist direkt an der Bildung der Schiff-Base beteiligt, und Lys201 könnte an der Beeinflussung des pK_a-Werts von Lys167 beteiligt sein.

Abbildung 2. Zweidimensionales Diagramm der Kontakte in der aktiven Stelle (Haridas, M.; et al. 2018)

Acetaldehyd-Resistenz von DERA

Jennerwein et al. nutzten Hochdurchsatz-Screening in Kombination mit Strategien der gerichteten Evolution, um Mutationen zu identifizieren, die sich positiv auf die katalytische Aktivität von DERA sowie auf die Chloroacetaldehyd-Resistenz auswirken. Sie stellten fest, dass die durch die Aminosäurereste Phe200, Ile166 und Met185 gebildeten hydrophoben Cluster sehr nahe an den aktiven Zentren Lys167 und Lys201 von DERA liegen. Durch Kombination der erfolgreichen Punktmutationen in DERA_EC erhielten sie unter industrierelevanten Bedingungen eine Variante mit zehnfach verbesserter Ausbeute an (3R,5S)-6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexapyranosid.

Wissenschaftler setzen häufig virtuelle Mutagenese und ortsgerichtete Mutagenese ein, um die Rigidität der Proteinstruktur zu beeinflussen. Varianten mit Mutationen an den Positionen 120, 174 und 213 zeigen ebenfalls eine erhöhte Toleranz, jedoch ist die Ausgangsaktivität um 50 % reduziert. Dick et al. identifizierten das Aldolkondensationsprodukt aus zwei Acetaldehydmolekülen als DERA-Inhibitor. Ein Austausch des katalytischen Restes Lys167 ist nahezu unmöglich, ohne die Enzymfunktion zu verlieren. Daher gilt der Austausch von Cystein gegen eine nicht-nukleophile Aminosäure wie Methionin als beste Option zur Herstellung eines acetaldehydresistenten Enzyms. Die Variante Cys47Met ist weiterhin die bislang aldehydresistenteste berichtete DERA_EC-Variante.

Abbildung 3. Kristallstruktur der E. coli-DERA (Haridas, M.; et al. 2018)