DERA

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Einführung

2-Deoxy-d-ribose-5-phosphate Aldolase (DERA) katalysiert die reversible Aldolreaktion von Acetaldehyd und Glycerinaldehyd-3-phosphat (G3P), um 2-Deoxyribose-5-phosphat (DR5P) zu bilden. Dieses Enzym ist unter den Aldolasen besonders, da es Aldehyde anstelle von Ketonen als natürlichen Donor verwendet. Alle bekannten DERAs arbeiten nach dem Klasse-I-Mechanismus. DERA kann viele Aldehyde mit langen Ketten von bis zu vier Kohlenstoffatomen akzeptieren und ein (S)-konfiguriertes stereogenes Zentrum in G3P erzeugen. Eine weitere interessante Eigenschaft von DERA ist, dass es die sequenzielle Aldolreaktion katalysieren kann, um 2,4,6-Trideoxyhexosen zu produzieren, die als wertvolle Zwischenprodukte für Atorvastatin und cholesterinsenkende Medikamente verwendet werden können. Es wurde festgestellt, dass die sequenzielle Addition von zwei Molekülen Acetaldehyd und Chloroacetaldehyd zu einem hoch stereospezifischen Polyolsystem führen kann, in dem die Stereoauswahl vom Enzym und nicht vom Substrat kontrolliert wird. Diese sequenzielle Aldolreaktion wird thermodynamisch kontrolliert und stoppt, wenn ein stabiler intramolekularer Hemiacetal gebildet wird. 

Abbildung 1. Die in vivo 2-Deoxy-D-ribose-5-phosphat-Reaktion, die von DERA katalysiert wird (Haridas, M.; et al. 2018)

DERA wird durch das deoC-Gen kodiert. Die Sequenz von DERA_EC wurde erstmals 1982 berichtet, als das Enzym aus dem E. coli-Stamm K-12 isoliert wurde. Das Enzym besteht aus 259 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 27,7 kDa. Die Aminosäurezusammensetzung des aus S. typhimurium isolierten Enzyms wurde schon lange berichtet. In den letzten Jahren wurde DERA in einer Vielzahl von Pflanzen- und Tiergeweben identifiziert, und diese Gewebe wurden nach mehreren Parametern charakterisiert. Bei Menschen wird es am meisten in Lungen- und Leberzellen exprimiert und beteiligt sich an der Stressreaktion, indem es den stressinduzierten Schaden in diesen Zellen verzögert oder minimiert.

Die Röntgenstruktur von DERA_EC zeigt, dass das Enzym eine gemeinsame TIM (α/β) ₈-Fassstruktur ist. Laut der Strukturuntersuchung existiert das Enzym als Dimer. Nach dem Vergleich der Kristallstrukturen von DERA aus verschiedenen Organismen wurde festgestellt, dass Wassermoleküle in allen Kristallstrukturen konserviert sind, was auf ihre Bedeutung im katalytischen Mechanismus hinweist. Die strukturelle Studie des aus dem Archaeon Aeropyrum pernix isolierten Enzyms zeigt, dass seine Monomerstruktur der von DERA_EC sehr ähnlich ist, aber in einer stabilen Tetramerstruktur existiert. Die Tetramerform spielt eine wichtige Rolle bei der Verbesserung der thermischen Stabilität des Proteins, hat jedoch keinen Einfluss auf die katalytische Aktivität.

Spätere kristallographische Studien identifizierten ein Carbinolamin-Intermediat und einen zweiten Lysinrest an Position 201 (Lys), der sehr nahe an Lys167 liegt. Nachfolgende Studien haben gezeigt, dass Lys167 und Lys201 entscheidend für die katalytische Aktivität von DERA sind, wobei Lys167 direkt an der Bildung der Schiff-Basis beteiligt ist und Lys201 möglicherweise an der Störung des pKa von Lys167 beteiligt ist.

Abbildung 2. Zweidimensionales Diagramm zeigt die Kontakte der aktiven Seite (Haridas, M.; et al. 2018)

Acetaldehydresistenz von DERA

Jennerwein et al. verwendeten Hochdurchsatz-Screening in Kombination mit gezielten Evolutionsstrategien, um Mutationen zu identifizieren, die einen positiven Effekt auf die katalytische Aktivität von DERA und die Chloroacetaldehydresistenz haben. Sie fanden heraus, dass die hydrophoben Cluster, die durch die Aminosäurereste Phe200, Ile166 und Met185 gebildet werden, sehr nahe an den aktiven Stellen Lys167 und Lys201 von DERA liegen. Durch die Kombination der erfolgreichen Punktmutationen in DERA_EC erhielten sie eine zehnfach verbesserte Variante von (3R,5S)-6-Chloro-2,4,6-Trideoxyhexapyranosid unter industriell relevanten Bedingungen.

Wissenschaftler verwenden oft virtuelle Mutationen und gerichtete Mutagenese, um die Steifigkeit der Proteinstruktur zu beeinflussen. Varianten, die an den Positionen 120, 174 und 213 mutiert wurden, zeigen ebenfalls eine verbesserte Toleranz, aber die anfängliche Aktivität wird um 50 % reduziert. Dick et al. identifizierten das Aldol-Kondensationsprodukt zwischen zwei Acetaldehydmolekülen als DERA-Inhibitoren. Es ist fast unmöglich, das katalytische Rest Lys167 auszutauschen, ohne die Funktion des Enzyms zu verlieren. Daher wird der Austausch von Cystein durch eine nicht-nukleophile Aminosäure wie Methionin als die beste Wahl für die Herstellung eines acetaldehydresistenten Enzyms angesehen. Die Cys47Met-Variante bleibt die bisher am meisten aldehydresistente DERA_EC-Variante.

Abbildung 3. Kristallstruktur E. coli DERA (Haridas, M.; et al. 2018)