DMGO

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Abstract

Mammalian Sarcosin-Dehydrogenase (SDH) und Dimethylglycin-Dehydrogenase (DMGDH) sind mitochondriale Enzyme, die am Cholin- und 1-Kohlenstoff-Stoffwechsel beteiligt sind. SDH spielt eine wichtige Rolle im Glycin/Sarcosin-Regulationszyklus, und sein Mangel führt zu Sarcosinämie, einem seltenen autosomalen Stoffwechseldefekt, der sich durch erhöhte Blut- und Urin-Sarcosinwerte äußert. Ein Mangel an DMGDH führt zu erhöhten Werten von N, N-Dimethylglycin im Blut. Diese eng verwandten Enzyme binden kovalent an FAD und katalysieren die Oxidation von Sarcosin und Dimethylglycin zu den entsprechenden Produkten Glycin und Sarcosin in der reduktiven Halbreaktion. In Abwesenheit von Tetrahydrofolat (THF) ist Formaldehyd das zweite katalysierte Produkt, das durch Hydrolyse eines labilen Imin-Intermediats entsteht. Das Elektronentransfer-Flavoprotein (ETF) verbindet die Aktivitäten von SDH und DMGDH mit der respiratorischen Redoxkette in einer oxidativen Halbreaktion, die den katalytischen Zyklus vervollständigt.

Die primären Strukturen dieser Enzyme zeigen das Vorhandensein von zwei aktiven Stellen, die sich in verschiedenen Regionen des Proteins befinden. Ein Nukleotidbindungsmotiv am N-Terminus von SDH und DMGDH deutet darauf hin, dass sie weiter entfernt mit dem bakteriellen monomeren Sarcosin-Oxidase (MSOX) verwandt sind. Die C-terminale Sequenz ist der des T-Proteins (einer Aminomethyltransferase) des Glycin-Spaltungs-Systems sehr ähnlich. Sarcosin oder Betain ist eine häufige Quelle für Kohlenstoff und Energie für viele Mikroorganismen, und Glycin-Betain ist ebenfalls ein Osmoprotektor.

Dimethylglycin-Oxidase (DMGO) aus Arthrobacter globiformis ist Teil des Betain-abbaubaren Stoffwechselwegs und ist zu 30 % identisch mit der Säugetier-SDH und DMGDH. DMGO verwendet molekularen Sauerstoff anstelle von ETF in der oxidativen Halbreaktion, aber wie SDH und DMGDH ist die Substratoxidation mit der Bildung von 5,10-Methylen-THF oder Formaldehyd verbunden, abhängig von der Verfügbarkeit von THF.

Overall structure of DMGO

Die 1,60 Å Kristallstruktur von DMGO wurde durch den MIRAS-Ansatz bestimmt. Das Enzym wurde als Dimer von eng gepackten Dimeren beobachtet, wobei die vier Monomere durch 222 kristallographische Punkt-Symmetrie miteinander verbunden sind. Konsistent mit der Proteinsequenzanalyse enthielt jedes Monomer zwei funktionell unterschiedliche Regionen. Die N-terminale Region, die für die Oxidation von Dimethylglycin verantwortlich ist, umfasst die Reste 1-420. Die C-terminale Region (Reste 421-830) enthält die zweite aktive Stelle, die für die Bildung von 5,10-Methylen-THF verantwortlich ist.

Abbildung 1. Stereoansicht eines DMGO-Monomers (Leys, D.; et al. 2003)

Quaternary structure

Die 222 Punkt-Symmetrie des Kristalls ist konsistent mit der internen Symmetrie des Tetramers. Die gesamte Struktur ähnelt einem abgeflachten Tetraeder mit Abmessungen von etwa 120×120×70 Å. Die FAD-Domäne nimmt die vier Ecken ein, und die C-terminale Domäne befindet sich im Zentrum des Tetraeders. Die Schnittstellen zwischen einem Monomer und zwei kristallographisch verwandten Molekülen sind sehr unterschiedlich. Die stärkste Wechselwirkung tritt mit den -x, y, -z symmetrieverwandten Monomeren auf und besteht fast ausschließlich aus der Folatbindungsdomäne. Der Wert der Formkomplementarität (SC), der mit der 1,7 Å Sonde erhalten wurde, beträgt 0,76. Analytische Gel-Filtrations-Experimente zeigten, dass die Größe des Proteins etwas größer war als für ein Homodimer vorhergesagt, möglicherweise aufgrund der Dissoziation des Proteins in Dimere bei niedrigen Protein-Konzentrationen. Derzeit gibt es keinen Hinweis darauf, dass DMGO einen allosterischen Effekt hat, und die Tetramerisierung könnte mit einer verbesserten Enzymstabilität verbunden sein. Trotz hoher Gesamtsequenzidentität sind keine der Schnittstellenkontaktreste in DMGO unter Säugetier-Dehydrogenasen konserviert, was darauf hindeutet, dass die quartäre Organisation unter Säugetierenzymen unterschiedlich sein könnte.

Abbildung 2. Struktur des DMGO-Tetramers (Leys, D.; et al. 2003)

Folate-binding region

Die drei Domänen, die sich in der C-terminalen Folatbindungsregion befinden, sind um das zentrale Loch in einer kleeblattartigen Anordnung angeordnet. Es wurde keine signifikante strukturelle Homologie mit bekannten Strukturen gefunden. Domäne 1 (Reste 469-507 und 600-689) ist ein sechssträngiges antiparalleles β-Faltblatt, das auf einer Seite von mehreren α-Helices gepackt ist. Es wird von einer unregelmäßigen Struktur gefolgt, die aus mehreren kleinen sekundären Elementen besteht.  Domäne 1 wird durch einen einzigen Ausbruch der Polypeptidkette unterbrochen, der ein fünfsträngiges antiparalleles β-Faltblatt bildet, Domäne 2 (Reste 508-599). Die Domänen 1 und 2 haben eine ähnliche Topologie und Faltung. Die C-terminale Domäne 3 (Reste 743-830) ist ein verzerrter sechssträngiger Jelly Roll, der vertikal mit den β-Faltblättern der Domänen 1 und 2 gepackt ist.

Abbildung 3. Stereoansicht der N5, N10-Methylen-THF-Synthase-Domäne (Leys, D.; et al. 2003)