DNA-Polymerase

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Einleitung

DNA-Polymerasen sind ubiquitär vorkommende Enzyme, die in lebenden Zellen komplementäre DNA-Stränge unter Verwendung von DNA als Matrize synthetisieren. Aus nahezu jedem Organismus wurden zahlreiche Enzyme identifiziert, und umfangreiche Studien wurden durchgeführt, um die gemeinsamen Funktionen dieser Enzyme zu untersuchen. Neben ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung der Genomintegrität während Replikation und Reparatur können DNA-Polymerasen auch bei der in vitro-Manipulation von DNA eine wichtige Rolle spielen, z. B. beim DNA-Klonieren, Sequenzieren, Markieren, bei der Mutagenese und weiteren Anwendungen. Die Fähigkeit von DNA-Polymerasen, Desoxyribonukleotidketten zu synthetisieren, ist konserviert. Prozessivität, Fidelity (Synthesegenauigkeit) und Substratselektivität für Nukleotide unterscheiden sich jedoch erheblich zwischen den Enzymen. Die Nutzung der unterschiedlichen und einzigartigen Eigenschaften der jeweiligen DNA-Polymerase kann die Entwicklung spezifischer Reagenzien unterstützen; daher zählt die Suche nach neuen DNA-Polymerasen zu den zentralen Schwerpunkten dieses Forschungsfeldes. In den letzten Jahren wurden mithilfe proteintechnischer Verfahren eine Vielzahl leistungsfähiger DNA-Polymerasen für spezifische Zwecke der DNA-Manipulation erfolgreich entwickelt. Thermostabile DNA-Polymerasen sind insbesondere für PCR-bezogene Techniken in der Molekularbiologie von besonderer Bedeutung.

Abbildung 1. Verteilung von DNA-Polymerasen in den drei Domänen des Lebens (Ishino, S.; Ishino, Y. 2014)

Am Anfang: Taq-Polymerase

Die bekannteste thermostabile DNA-Polymerase ist die DNA-Polymerase I aus Thermus aquaticus, die sogenannte Taq-Polymerase. Taq-Polymerase wurde ursprünglich aus T. aquaticus identifiziert, das im Yellowstone-Nationalpark, Montana, USA, isoliert wurde, als dies von Chien et al. publiziert wurde; jedoch konnte damals niemand vorhersehen, dass dieses Enzym eine derartige Bekanntheit erlangen würde. Die PCR-Technik (Polymerase-Kettenreaktion) unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I aus Escherichia coli wurde 1985 beschrieben. Hitzestabile DNA-Polymerasen, die während des Denaturierungsschritts (Umwandlung doppelsträngiger in einzelsträngige DNA) nicht inaktiviert werden, waren entscheidend dafür, die PCR-Methode zu einer breit anwendbaren praktischen Technik weiterzuentwickeln. In der Folge wurde eine einfache und zuverlässige PCR-Methode unter Einsatz der Taq-Polymerase entwickelt. Aufgrund der überlegenen Thermostabilität der Taq-Polymerase konnte nach Ansatz des Reaktionsgemisches einschließlich DNA-Polymerase das Reaktionsgefäß im Thermocycler verbleiben; während des Experiments war lediglich die Temperatur zu verändern.

PCR-Kits und Geräte, die schnelle Temperaturwechsel der Reaktionsansätze ermöglichen, erschlossen den PCR-Markt. Taq-Polymerase wurde zunächst aus T. aquaticus-Zellen gereinigt; anschließend wurde das pol-Gen aus dem T. aquaticus-Genom kloniert und erfolgreich in E. coli-Zellen exprimiert. Kommerziell wurde die native Taq-Polymerase durch eine rekombinante Taq-Polymerase ersetzt, die als AmpliTaq DNA-Polymerase bezeichnet wird. Die Ausbeute rekombinanter Taq-Polymerase in E. coli-Zellen war aufgrund der geringen Expression des T. aquaticus-Gens mit hohem GC-Gehalt (70 %) zunächst sehr niedrig. Später wurde das System optimiert, wodurch die Taq-Polymerase-Produktion um mehr als das 10-Fache gesteigert werden konnte. Es wurden umfangreiche PCR-Daten unter Verwendung der Taq-Polymerase gesammelt, die eine wertvolle Grundlage für die Entwicklung neuer Produkte zur Modifikation der PCR darstellen.

Proteinengineering thermostabiler DNA-Polymerasen

Taq-Polymerase ist ein Enzym der Familie A und kann für die praktische Didesoxy-Sequenzierung eingesetzt werden. Die Qualität der Sequenzierdaten mit Taq-Polymerase war jedoch im Vergleich zu den Ergebnissen mit der T7-DNA-Polymerase (Sequenase) weniger zufriedenstellend. Mithilfe einer ausgeklügelten Proteinengineering-Strategie gelang es, eine mutierte Taq-Polymerase zu entwickeln, die für die Didesoxy-Sequenzierung besser geeignet ist als die Wildtyp-Taq-Polymerase.

E. coli PolI und Taq-Polymerase unterscheiden als Substrate für den Einbau in den DNA-Strang zwischen Desoxy- und Didesoxynukleotiden. Die T7-DNA-Polymerase hingegen baut Desoxynukleotide und Didesoxynukleotide in vergleichbarem Maße ein, wodurch sich sehr klare Signale leichter erzielen lassen. Eine T7-DNA-Polymerase ohne 3'-5'-Exonukleaseaktivität wurde als kommerzielles Produkt unter dem Namen Sequenase entwickelt.

Die Strategie des „Domain Tagging“ kann erfolgreich verbesserte DNA-Polymerasen hervorbringen. So werden beispielsweise neue DNA-Polymerasen erzeugt, indem die Helix-Hairpin-Helix-(HhH)-Domäne der Topoisomerase V aus Methanopyrus kandleri mit den katalytischen Domänen der Taq-Polymerase und der Pfu-Polymerase verknüpft wird. HhH vermittelt eine sequenzunspezifische DNA-Bindung. Diese Hybridenzyme weisen verbesserte Eigenschaften auf, darunter erhöhte Thermostabilität sowie eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Salzen und Inhibitoren wie Blut, Phenol und DNA-interkalierenden Farbstoffen. Ein weiteres erfolgreiches Beispiel einer Tagging-Strategie ist die Entwicklung des kommerziellen Produkts „Phusion DNA Polymerase“. Dabei handelt es sich um ein Fusionsprotein aus Pfu-DNA-Polymerase und dem DNA-Bindeprotein Sso7d aus S. solfataricus. Im Vergleich zur Pfu-DNA-Polymerase zeigt dieses Enzym relativ hohe Verlängerungsraten bei gleichzeitig hoher Fidelity. Es weist eine sehr hohe Prozessivität und eine präzise PCR-Performance auf und wird daher breit eingesetzt.

Abbildung 2. Schematische Darstellungen einer prozessiven PCR unter Verwendung einer DNA-Polymerase der Familie B (Ishino, S.; Ishino, Y. 2014)