DNA-Polymerase

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Einführung

DNA-Polymerase ist ein ubiquitär vorkommendes Enzym, das für die Synthese komplementärer DNA-Stränge verantwortlich ist, indem es DNA in lebenden Zellen als Vorlage verwendet. Viele Enzyme wurden aus jedem Organismus identifiziert, und zahlreiche Studien wurden durchgeführt, um die gemeinsamen Funktionen dieser Enzyme zu untersuchen. Neben ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung der Genomintegrität während der Replikation und Reparatur können DNA-Polymerasen auch wichtige Rollen bei der DNA-Manipulation in vitro spielen, wie z.B. DNA-Klonierung, Sequenzierung, Markierung, Mutagenese und mehr. Die Fähigkeit der DNA-Polymerasen, Desoxyribonukleotidketten zu synthetisieren, ist konserviert. Ihre Prozessivität, Genauigkeit (Synthesepräzision) und Substratnukleotidselektion variieren jedoch erheblich zwischen den Enzymen. Die Nutzung der unterschiedlichen und einzigartigen Eigenschaften jeder DNA-Polymerase kann die Entwicklung einzigartiger Reagenzien unterstützen, sodass die Suche nach neuen DNA-Polymerasen eines der Hauptaugenmerke dieses Forschungsfeldes war. In den letzten Jahren wurden eine Vielzahl leistungsstarker DNA-Polymerasen erfolgreich entwickelt, die mithilfe von Proteinengineering-Techniken für eine Vielzahl spezifischer Zwecke in der DNA-Manipulation eingesetzt werden. Thermostabile DNA-Polymerasen sind besonders wichtig für PCR-bezogene Techniken in der Molekularbiologie.

Abbildung 1. Verteilung der DNA-Polymerasen in den drei Lebensbereichen (Ishino, S.; Ishino, Y. 2014)

Am Anfang: Taq-Polymerase

Die repräsentativste thermostabile DNA-Polymerase ist DNA-Polymerase I von Thermus aquaticus, nämlich Taq-Polymerase. Taq-Polymerase wurde ursprünglich aus T. aquaticus isoliert, das im Yellowstone-Nationalpark, Montana, USA, gefunden wurde, als es von Chien et al. veröffentlicht wurde, jedoch konnte niemand voraussehen, dass dieses Enzym so berühmt werden würde. Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion)-Technik, die das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von Escherichia coli verwendet, wurde 1985 berichtet. Wärmebeständige DNA-Polymerasen, die während des Schrittes der Denaturierung von doppelsträngiger DNA zu einzelsträngiger DNA nicht inaktiv werden, haben eine entscheidende Rolle dabei gespielt, die PCR-Methode in eine breite Palette praktischer Techniken zu transformieren. Anschließend wurde eine einfache und zuverlässige PCR-Methode unter Verwendung von Taq-Polymerase erfunden. Aufgrund der überlegenen thermischen Stabilität der Taq-Polymerase konnte das Reaktionsgemisch, das DNA-Polymerase enthielt, im Inkubator verbleiben, und es musste nur die Temperatur während des Experiments geändert werden.

PCR-Kits und Instrumente, die in der Lage sind, die Reaktionstemperaturen schnell zu ändern, eröffneten den PCR-Markt. Taq-Polymerase wurde aus T.aquaticus-Zellen gereinigt, und dann wurde das pol-Gen aus dem T.aquaticus-Genom kloniert und erfolgreich in E. coli-Zellen exprimiert. Kommerziell wurde die native Taq-Polymerase durch eine rekombinante Taq-Polymerase namens AmpliTaq DNA-Polymerase ersetzt. Die Menge an rekombinanter Taq-Polymerase, die in E. coli-Zellen produziert wurde, war aufgrund der niedrigen Expression des T. aquaticus-Gens mit hohem GC-Gehalt (70%) sehr gering. Später wurde sie optimiert, um die Produktion von Taq-Polymerase um mehr als das 10-Fache zu verbessern. Eine große Menge an PCR-Daten, die mit Taq-Polymerase erzeugt wurden, wurde angesammelt und bietet eine wertvolle Ressource für die Entwicklung neuer Produkte für PCR-Modifikationen.

Proteinengineering von thermostabilen DNA-Polymerasen

Taq-Polymerase ist ein Enzym der Familie A, das für praktische Dideoxy-Sequenzierung verwendet werden kann. Allerdings war die Ausgabe von Sequenzierungsdaten der Taq-Polymerase im Vergleich zu den Ergebnissen der T7-DNA-Polymerase (Sequenase) weniger als ideal. Mit einer ausgeklügelten Proteinengineering-Strategie gelang es den Wissenschaftlern, eine mutierte Taq-Polymerase zu entwickeln, die besser für die Dideoxy-Sequenzierung geeignet war als die Wildtyp-Taq-Polymerase.

E. coliPolI und Taq-Polymerasen unterscheiden zwischen Desoxynukleotiden und Dideoxynukleotiden als Substrate für die Einfügung in den DNA-Strang. T7-DNA-Polymerase fügt sowohl Desoxynukleotide als auch Dideoxynukleotide gleichmäßig ein, was es einfacher macht, sehr klare Signale zu erhalten. Eine T7-DNA-Polymerase, die keine 3'-5'-Exonuklease-Aktivität aufweist, wurde als kommerzielles Produkt entwickelt, das Sequenase genannt wird.

Die "Domain-Tagging"-Strategie kann erfolgreich verbesserte DNA-Polymerasen erzeugen. Zum Beispiel werden neue DNA-Polymerasen erzeugt, indem die Helix-Haarpin-Helix (HhH)-Domain der Methanopyrus kandleri Topoisomerase V an die katalytischen Domänen der Taq-Polymerase und der Pfu-Polymerase gekoppelt wird. HhH wirkt auf sequenzunspezifische DNA-Bindung. Diese Hybridenzyme haben verbesserte Eigenschaften, wie erhöhte Thermostabilität und starke Resistenz gegen Salze und Inhibitoren wie Blut, Phenol und DNA-interkalierende Farbstoffe. Ein weiteres erfolgreiches Beispiel für eine Tagging-Strategie ist die Schaffung des kommerziellen Produkts "Phusion DNA-Polymerase". Dies ist ein Fusionsprotein der Pfu-DNA-Polymerase und des DNA-Bindungsproteins Sso7d aus S. solfataricus. Im Vergleich zur Pfu-DNA-Polymerase hat dieses Enzym relativ hohe Verlängerungsraten bei gleichzeitiger Beibehaltung einer hohen Genauigkeit. Dieses Enzym zeigt eine sehr hohe Prozessivität und genaue PCR-Leistung, sodass es weit verbreitet eingesetzt wird.

Abbildung 2. Schematische Diagramme der prozessiven PCR unter Verwendung einer DNA-Polymerase der Familie B (Ishino, S.; Ishino, Y. 2014)