Endo-1,4-β-Mannanase

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Einleitung

β-Mannanase (endo-1,4-β-mannan mannanohydrolase, EC 3.2.1.78) ist für die zufällige Hydrolyse von β-1,4-mannosidischen Bindungen in Mannan, Glucomannan, Galactomannan, Galactomannan und Galactoglucomannan verantwortlich. Im Alltag ist Amophophallus konjac eine gute Quelle für Glucomannan und ein Knollengemüse, das in einigen tropischen Ländern wie Japan, Bangladesch und Indien weit verbreitet verzehrt wird. Charakteristisch für β-Mannanase ist die effiziente Nutzung von β-Mannan aus verschiedenen Pflanzen als biologische Ressource zur Herstellung wertvoller Oligosaccharide. Als Hydrolyseprodukte spielen die Oligosaccharide eine sehr wichtige Rolle für das Wachstum intestinaler Mikroorganismen, insbesondere von Bifidobakterien, die günstige Effekte auf intestinale Mukosazellen und andere Darmmikroflora zeigen und dadurch die Stuhlmasse erhöhen. Mannanase kann auch in industriellen Produktionsprozessen eingesetzt werden, z. B. bei der Gewinnung von Pflanzenöl aus leguminösen Samen sowie zur Unterstützung der Herstellung von Instantkaffee, Schokolade und Kakaomasse, indem die Viskosität des Extrakts reduziert wird. Mannanase kann zudem zur Vorbleiche von Nadelholz-Zellstoff mit synergistischer Unterstützung durch Xylanase eingesetzt werden. Trotz ihres hohen praktischen Potenzials ist die Anwendung von Mannanase aufgrund geringer Ausbeuten und hoher Produktionskosten weiterhin eingeschränkt.

In jüngerer Zeit richtet sich verstärkte Aufmerksamkeit auf die Gewinnung und Nutzung von β-Mannanase aus unterschiedlichen Quellen wie Pflanzen, Bakterien, Pilzen, Actinomyceten und Mollusken. Vergleichende Untersuchungen von aus Bakterien isolierter β-Mannanase zeigten, dass sich die quantitative Enzymproduktion und die Hydrolyseeffizienz je nach Spezies unterscheiden, sogar zwischen verschiedenen Stämmen derselben Spezies. Beim Speziesvergleich werden bei Bedarf großer Enzymmengen Enzyme aus bakteriellen Quellen bevorzugt. 

Eigenschaften des Enzyms

Die Molekülmassen des aus dem Stamm Bacillus subtilis KU-1 gereinigten Enzyms, bestimmt mittels Gelfiltration und SDS-PAGE, betrugen 40 kDa bzw. 39 kDa. Das Enzym zeigt eine optimale Aktivität bei pH 7,0 und bei 50–55 °C und ist bei 60 °C über 1 Stunde stabil. Darüber hinaus behält das Enzym nach Lagerung in NaAc-Puffer bei Raumtemperatur (ca. 25 °C) und pH 6,5 über 2 Wochen weiterhin mehr als 80 % seiner maximalen Aktivität. Der isoelektrische Punkt des Enzyms lag bei 4,5. Gemäß Lineweaver-Burk-Darstellung betragen die berechnete Michaelis-Konstante (K_m) und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (V_max) 0,91 % bzw. 2935 U mg^-1. Nach Inkubation des Enzyms mit einer Metallverbindung in einer Konzentration von 1 mM über 24 Stunden zeigten Hg²⁺, Ag²⁺, Cu²⁺, Mn²⁺ und Cr²⁺ einen starken inhibitorischen Effekt auf die Enzymaktivität.

Nach vollständiger Säurehydrolyse des Enzyms wird die Aminosäurezusammensetzung mittels Aminosäureanalysator bestimmt. Die gemessene Aminosäurezusammensetzung (% mol) des Enzyms wird wie folgt berechnet: Asx 15,1; Glx 11,4; Gly 5,6; Ala 6,7; Val 2,2; 1/2Cys 0,3; Met 1,7; Ile 4,2; Leu 9,3; Phe 5,1; Lys 5,3; His 2,7; Arg 3,4; Pro 6,3; basierend auf den Mittelwerten nach 24-, 48- und 72-stündiger Hydrolyse.

Das Enzym hydrolysiert Konjac-Glucomannan, β-Mannan, Lärchenholz-Xylan, Johannisbrotkernmehl, Guarkernmehl, Cellulose und Inulin mit relativen Reaktivitäten von 100, 106, 66, 58, 54, 13 bzw. 27 %. Es zeigt jedoch keine hydrolytische Aktivität gegenüber anderen Substraten wie Hafer, Birkenholz-Xylan, Carrageen, Cyclodextrinen (α, β, γ), Pektin, Dextran, Hefeglukan, Laminarin und Lichenan etc. Bei allen oligomeren Produkten wird Mannose am reduzierenden Ende nachgewiesen.