Endonuklease

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Einführung

Endonukleasen sind eine Enzymklasse, die spezifische Nukleotidsequenzen erkennen und binden sowie die Phosphodiesterbindung zwischen zwei Desoxyribonukleotiden an definierten Stellen in jedem Strang spalten können; diese werden als Restriktionsenzyme bezeichnet. In Abhängigkeit von der Struktur der Restriktionsenzyme, den für die Spaltung erforderlichen Kofaktoren und der Wirkungsweise lassen sich Restriktionsenzyme in drei Typen einteilen: Typ I, Typ II und Typ III. Restriktionsendonukleasen vom Typ I katalysieren sowohl die Methylierung der Wirts-DNA als auch die Hydrolyse nicht methylierter DNA, während Restriktionsendonukleasen vom Typ II ausschließlich die Hydrolyse nicht methylierter DNA katalysieren. Restriktionsendonukleasen vom Typ III besitzen sowohl modifizierende als auch erkennungs- und spaltungsbezogene Funktionen.

Verbreitung

Restriktionsendonukleasen sind weit verbreitet; in nahezu allen Gattungen und Arten von Bakterien findet sich mindestens eine Restriktionsendonuklease, in einer Gattung mitunter Dutzende – beispielsweise wurden in der Gattung Haemophilus (Haemophilus) 22 identifiziert. Einige Stämme weisen einen sehr niedrigen Enzymgehalt auf, was die Isolierung und Charakterisierung erschwert; in anderen Stämmen ist der Enzymgehalt hingegen sehr hoch. So gelten beispielsweise pMB4 (EcoRI-Enzym) und H. aegyptius (Hal-Ⅲ-Enzym) von E. coli als Hochproduzenten. Es wurde berichtet, dass aus 10 g Zellen von H. aegyptius eine Enzymmenge isoliert und gereinigt werden konnte, die 10 g λ-Phagen-DNA verdauen kann. Bakterien sind eine Hauptquelle für Restriktionsendonukleasen, insbesondere für die hochspezifischen Restriktionsendonukleasen der Klasse I.

Typen

Auf Grundlage der Struktur der Restriktionsenzyme, der für die Spaltung erforderlichen Kofaktoren sowie der Wirkungsweise lassen sich Restriktionsenzyme in drei Typen klassifizieren: Typ I, Typ II und Typ III.

• Restriktionsendonukleasen vom Typ I

Restriktionsenzyme vom Typ I besitzen sowohl Modifikations- als auch Restriktions-/Erkennungsfunktionen; sie können spezifische Basensequenzen auf der DNA erkennen, und die Spaltstelle kann üblicherweise Tausende Basen von der Erkennungsstelle entfernt liegen.

• Restriktionsendonukleasen vom Typ II

Sie erkennen ausschließlich die Spaltstelle; die Modifikation wird durch andere Enzyme durchgeführt. Die Erkennungsstelle ist meist eine kurze palindromische Sequenz; die geschnittene Basensequenz entspricht in der Regel der Erkennungssequenz. Dies ist ein für die Gentechnik besonders nützliches Restriktionsenzym.

• Restriktionsendonukleasen vom Typ III

Ähnlich wie Restriktionsenzyme vom Typ I verfügen sie sowohl über modifizierende als auch über Erkennungsfunktionen. Sie können kurze asymmetrische Sequenzen erkennen, und die Spaltstelle liegt etwa 24–26 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt.

Anwendungen

• Zur Erstellung physikalischer Karten von DNA-Genomen, zur Genlokalisierung und Genisolierung, zur Basensequenzanalyse von DNA-Molekülen, zum Vergleich verwandter DNA-Moleküle sowie für die Gentechnik, einschließlich der Durchführung gentechnischer Editierungen.
• Restriktionsendonukleasen werden von Bakterien produziert; ihre physiologische Bedeutung liegt in der Verbesserung der eigenen Abwehrfähigkeit.
• Restriktionsenzyme schneiden in der Regel nicht die eigenen DNA-Moleküle, sondern nur exogene DNA.

Physiologische Bedeutung

• Restriktion ist ein Schutzmechanismus, der den enzymatischen Abbau exogener DNA begrenzt und die genetische Stabilität des Wirts aufrechterhält. Methylierung ist eine häufige Modifikationswirkung, die durch Methylierung von Adenin (A) und Cytosin (C) schützt.
• Die Methylierung dient dem Zweck, eigenes genetisches Material von fremdem genetischem Material zu unterscheiden. Daher können Bakterien, die ein Restriktionsenzym zur Abwehr viraler Infektionen produzieren, die vom Enzym erkannte Sequenz in ihrem eigenen Genom tragen; lediglich die Erkennungssequenz oder die Spaltstelle ist methyliert.
• Die Fähigkeit, methylierte DNA zu spalten, ist eine intrinsische und nicht vorhersagbare Eigenschaft von Restriktionsenzymen; daher müssen für eine effiziente DNA-Spaltung sowohl die DNA-Methylierung als auch die Empfindlichkeit des Restriktionsenzyms gegenüber dieser Art der Methylierung berücksichtigt werden.