Fpg-Protein

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Biochemie von Fpg

Fpg (EC 3.2.2.23), auch bekannt als 8‑Oxoguanin‑DNA‑Glykosylase oder MutM, ist eines der wichtigsten Enzyme im bakteriellen BER‑Reparaturweg (Base Excision Repair). Fpg schützt die DNA vor der Akkumulation von 8‑Oxoguanin (8‑oxoG), das dazu neigt, eine energetisch begünstigte syn-Konformation einzunehmen und dadurch mit Adenin ein Hoogsteen‑Basenpaar zu bilden. Der Einbau von dAMP gegenüber 8‑oxoG während der Replikation führt zu einer G→T‑Transversion. Fpg weist mehrere enzymatische Aktivitäten auf. Es wirkt als Glykosylase/AP‑Lyase, die für die Entfernung geschädigter Basen verantwortlich ist, gefolgt von einer Spaltung des DNA‑Rückgrats an der Schadstelle durch β‑Eliminierung.

Fpg unterscheidet sich jedoch von den meisten anderen Glykosylasen/AP‑LyasEN durch seine Fähigkeit, zwei aufeinanderfolgende Eliminierungsschritte durchzuführen (häufig als „β‑Eliminierung“ und „δ‑Eliminierung“ bezeichnet, um sie zu unterscheiden). Das Endprodukt der Fpg‑Wirkung ist somit eine Einzel‑Nukleotid‑Lücke in der DNA, flankiert von zwei Phosphatgruppen. Darüber hinaus wirkt Fpg als Desoxyribophosphodiesterase‑Lyase und katalysiert die Entfernung von Desoxyribose‑5’‑Phosphat aus genickten apurinischen/apyrimidinischen (AP‑)Stellen in der DNA. Als Zwischenprodukt dieser katalytischen Reaktion wird eine kovalente Imin‑Bindung (Schiff‑Base) zwischen dem Enzym und dem C1’ des geschädigten Nukleotids gebildet, die mit Natriumborhydrid reduziert werden kann, um einen stabilen kovalenten Fpg‑DNA‑Komplex zu erzeugen. Neben 8‑oxoG und FaPy‑Läsionen exzidiert Fpg auch zahlreiche weitere modifizierte Purine und möglicherweise einige oxidierte Pyrimidine.

Strukturen von Fpg‑Proteinen aus verschiedenen bakteriellen Spezies

Strukturdaten für Fpg‑Proteine aus E. coli (Eco‑Fpg), Lactococcus lactis, Bacillus stearothermophilus und Thermus thermophilus sind derzeit verfügbar. Th. thermophilus‑Fpg wurde als nicht komplexiertes Protein aufgeklärt, während andere Fpg‑Proteine DNA‑gebunden analysiert wurden; die Proteinstrukturen waren insgesamt jedoch sehr ähnlich.

Fpg besteht aus N‑terminalen und C‑terminalen Domänen, die über Scharnier‑Polypeptide miteinander verbunden sind. Die N‑terminale Domäne enthält das aktive Zentrum für die Schiff‑Basen‑Bildung, wobei Pro‑1 als Nukleophil fungiert. Die C‑terminale Domäne enthält einen einzelnen Zinkfinger, der für die Bindung geschädigter DNA erforderlich ist. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Fpg‑DNA‑Interaktion auf Basis von Röntgenstrukturdaten.

Ähnlich wie die meisten anderen DNA‑Glykosylasen klappt Fpg das geschädigte Nukleotid aus der DNA in eine tiefe Tasche des aktiven Zentrums aus. Zur Erkennung der verwaisten, gegenüberliegenden Cytosinreste (C⁽⁰⁾) schiebt das Enzym den Arylring von Phe‑110 in den Raum zwischen C⁽⁰⁾ und der benachbarten Base (C⁽¹⁾) und geht dabei Face‑to‑Face‑Wechselwirkungen mit dem Pyrimidinring von C⁽¹⁾ ein, wodurch die beiden Basen entstapelt werden. C⁽⁰⁾ verbleibt innerhalb der Helix und wird durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen C⁽⁰⁾ sowie O² und N3 von Arg‑108 stabilisiert.

Abbildung 1. Schema der Fpg‑DNA‑Interaktionen (Zharkov, D.O. et al. 2003)

Beitrag struktureller Elemente der DNA zur Fpg‑Bindung

Die durch Fpg induzierten unspezifischen DNA‑Anpassungen an die katalytisch optimale Konformation konnten in Stopped‑Flow‑Experimenten nicht nachgewiesen werden. Bei vielen DNA‑abhängigen Enzymen sind diese Anpassung und die nachfolgenden katalytischen Schritte besonders sensitiv gegenüber der Beschaffenheit der DNA. Jedes Enzym stimmt die DNA‑Konformation auf seine Weise fein ab, häufig unter Einbeziehung eines partiellen Aufschmelzens von DNA‑Fragmenten, oft begleitet von Konformationsänderungen im DNA‑Rückgrat sowie einem partiellen oder vollständigen Entpacken der Basen. Die Ausbildung strukturell definierter Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Enzymen und spezifischen DNA‑Basen ist eine der letzten Stufen der Substratselektion. Die Ausbildung dieser Bindungen gewährleistet die korrekte Orientierung der spezifischen Basen im aktiven Zentrum des Enzyms und beschleunigt die Reaktion um 4–7 Größenordnungen.

Der Affinitätsanstieg beim Übergang von unspezifischen zu spezifischen doppelsträngigen ODNs (ds ODNs) hängt in gewissem Maße von der DNA‑Sequenz ab. Die Affinität zu spezifischen Hetero‑ODNs ist 50‑ bis 75‑fach höher als die Affinität zu d(pT)_14-15•d(pA)_14-15. Der relative Beitrag der spezifischen Interaktion von Fpg mit 8‑oxoG ist auf allen Ebenen (für minimale Liganden, ss und ds ODNs) vergleichbar, was darauf hindeutet, dass sich spezifische und unspezifische Interaktionen einzelner Nukleotide der DNA zur Gesamtaffinität von Fpg nahezu additiv verhalten. Fpg erkennt freie dNMPs über grundlegende additive Wechselwirkungen mit deren Strukturelementen, wobei der wesentliche Beitrag von der Phosphat‑Einheit stammt. Grundsätzlich ist keine absolute Additivität für Liganden zu erwarten, die unterschiedliche Strukturelemente von dNMPs approximieren. Fpg ist in der Lage, Mononukleotid‑Einheiten innerhalb der DNA sowie als freie dNMPs in nahezu additiver Weise mit vergleichbarer Affinität zu erkennen. Zusammenfassend kann die Interaktion von Fpg mit spezifischer DNA anhand des in Abbildung 2 dargestellten Modells angenähert werden.

Abbildung 2. Thermodynamisches Modell der Interaktionen von Fpg mit spezifischer DNA (Zharkov, D.O. et al. 2003)