G6Pase

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Einführung

Sowohl die Gluconeogenese als auch die Glykogenolyse führen zur Bildung von Glukose-6-phosphat (Glc-6-P), das von der Glukose-6-Phosphatase (G6Pase) hydrolysiert werden muss, um Glukose zu bilden, die in den Blutkreislauf freigesetzt wird. Daher spielt G6Pase eine Schlüsselrolle bei der Homöostase des Blutzuckers. Die Arbeiten von Coris zeigten, dass Glykogen durch Phosphorylierung zu Glukose-1-phosphat abgebaut wird, was bedeutet, dass das Phosphat zu einem späteren Zeitpunkt entfernt werden muss, um freie Glukose zu erzeugen. de Duve und Mitarbeiter zeigten, dass die Leber eine Phosphatase enthält, die spezifisch auf Glc-6-P wirkt. Nachfolgende Zellgradierungsstudien haben gezeigt, dass G6Pase mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziiert ist. Ein weiterer Fortschritt war die Entdeckung, dass ein Mangel an G6Pase die Glykogenspeicherkrankheit Typ I (GSD I) verursacht, sowie die Hypothese, die 1975 von Arion und Mitarbeitern aufgestellt wurde, dass die katalytische Stelle von G6Pase zur ER-Lumene zeigt und dass sie Transporter für 6-P, Glukose und P_i benötigt.

Kinetische Eigenschaften

Die Eigenschaften von G6Pase hängen von der Integrität der mikrosomalen Membran ab. In intakten Mikrosomen katalysiert sie spezifisch die Hydrolyse von Glc-6-P, und ihre Aktivität auf diesem Phosphoester ist mehr als 10-fach höher als die auf Mannose-6-phosphat (Man-6-P). Die Behandlung mit verschiedenen Detergenzien, einschließlich anionischer, kationischer und neutraler Detergenzien, stimuliert die Hydrolyse von Glc-6-P moderat, erhöht jedoch signifikant (10-15-fach) die Phosphataseaktivität auf anderen Substraten wie Man-6-P, Glucosamin-6-phosphat und 2-Desoxyglukose-6-phosphat. G6Pase hydrolysiert auch Substrate, die keine Zuckerphosphate sind, wie PP_i und Carbamoylphosphate. Da ihr Reaktionsmechanismus Phosphatase-Intermediäre umfasst, zeigt G6Pase auch Phosphotransferase-Aktivität, die in der Lage ist, Glc-6-P und Carbamoylphosphat aus Glukose und verschiedenen Phosphatdonoren wie PP_i und Man-6-P zu synthetisieren. Diese Aktivitäten von G6Pase waren in mit Detergenzien behandelten Mikrosomen ausgeprägter. Es wurde vorgeschlagen, dass G6Pase auch an der Phosphorylierung von Glukose teilnehmen kann, indem sie Carbamoylphosphat als Phosphatdonor verwendet, wenn die Zuckerkonzentrationen erhöht sind (wie bei Diabetes). Ein Mangel an G6Pase führt jedoch zu schwerer Hypoglykämie, und ihre Überexpression führt zu Glukoseintoleranz, was darauf hindeutet, dass die physiologische Rolle dieses Enzyms in der Glukoseproduktion liegt. Diese Schlussfolgerung steht im Einklang mit Studien an isolierten Hepatozyten, die zeigen, dass die Rate der Glukosephosphorylierung mit der Aktivität der Glukokinase korreliert.

Abbildung 1. Reaktionsmechanismus von G6Pase (SCHAFTINGEN, E.V. 2002)

cDNA und Gen

Die Klonierung der cDNA, die G6Pase kodiert, nutzte die niedrige Expression dieses Enzyms in Mäusen, die homozygot für die strahleninduzierte albino Mutation sind, die in den ersten Stunden nach der Geburt zu schwerer Hypoglykämie führt.  Die Aktivität anderer hepatischer Enzyme, einschließlich Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und Glutaminsynthase, war ebenfalls bei diesen Mäusen reduziert. Die differenzielle Screening der cDNA-Bibliothek führte zur Isolierung mehrerer Klone, die schwach in der Leber von homozygoten letalen albino Mutantenmäusen exprimiert wurden. Die Expression der cDNA in COS-Zellen zeigte, dass sie tatsächlich G6Pase kodiert. Die menschliche cDNA kodiert ein Protein derselben Größe wie die Maus-G6Pase. Beide sind 10-12 kb lang und enthalten fünf Exons. Das menschliche Gen befindet sich auf 17q21. Die cDNA-Sequenzen aus anderen Spezies sind ebenfalls beschrieben, einschließlich Ratte, Hund und zwei Fischarten.

Das Screening einer Mausinsulinom-Bibliothek ergab eine cDNA, die ein Protein kodiert, das zu 49 % identisch mit der Leber-G6Pase ist. Dieses Protein ist ebenfalls sehr hydrophob und hat ein Retentionssignal des endoplasmatischen Retikulums. Northern Blots zeigten, dass es nur in der endokrinen Bauchspeicheldrüse exprimiert wird. Die Maus-, Menschen- und Rattengene, die dieser cDNA entsprechen, wurden identifiziert und ihre Strukturen bestimmt. Sowohl Maus- als auch menschliche Gene befinden sich auf Chromosom 2 und haben eine Struktur mit fünf Exons wie das G6Pase-Gen. Das Rattengen scheint ein Pseudogen zu sein, da Exon 4 fehlt und die Exons 1 und 5 durch Frameshift-Mutationen unterbrochen sind. Die Rolle, falls vorhanden, des Produkts, das von diesem Gen in Menschen und Mäusen kodiert wird, ist derzeit unklar.

Abbildung 2. Substrat-Transportmodell (Arions Modell) (SCHAFTINGEN, E.V. 2002)