Granzyme B

Granzyme B (GzmB, EC 3.4.21.79) ist als eines der am häufigsten vorkommenden Mitglieder der Granzyme-Familie beim Menschen und bei Mäusen eine caspaseähnliche Serinprotease, die durch das GZMB-Gen kodiert wird und von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) sowie natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) zusammen mit dem porenbildenden Protein Perforin exprimiert wird, um in Zielzellen Apoptose zu vermitteln. In jüngerer Zeit wurde zudem gezeigt, dass GzmB von einer Vielzahl nicht-zytotoxischer Zellen produziert wird, darunter Basophile und Mastzellen bis hin zu glatten Muskelzellen. GzmB ist entscheidend für die rasche Induktion der Apoptose von Zielzellen durch CTL im Rahmen der zellvermittelten Immunantwort und kann Substrate C-terminal von Aspartatresten spalten. Es wurde nachgewiesen, dass GzmB doppelsträngige DNA-Fragmentierung sowie caspaseabhängigen oder -unabhängigen Zelltod auslösen kann.

GzmB zeigt zudem synergistische Effekte bei der viralen Clearance, ist jedoch allein nicht ausreichend, um ein breites Spektrum von Viren bei Infektionen zu eliminieren. Darüber hinaus ist GzmB an der Remodellierung der extrazellulären Matrix und an Entzündungsprozessen beteiligt, indem es die Zytokinfreisetzung stimuliert. Erhöhte GzmB-Spiegel werden mit einigen Autoimmunerkrankungen, mehreren Hauterkrankungen sowie Typ-1-Diabetes in Verbindung gebracht.

Molekulare Struktur

Beim Menschen ist GzmB, kodiert durch GZMB auf Chromosom 14q.11.2, 3,2 kb lang und besteht aus 5 Exons; es wird angenommen, dass es sich aus einem Granzyme-H-verwandten Vorläufer entwickelt hat und im Vergleich zu anderen Granzymen bei niedrigeren Konzentrationen wirksamer ist. In der GzmB-Struktur finden sich zwei 6-strängige β-Faltblätter sowie drei transdomänäre Segmente. In den Granula zytotoxischer Lymphozyten kann das Enzym in zwei glykosylierten Formen vorliegen. GzmB enthält in seinem aktiven Zentrum eine katalytische Triade aus Histidin, Aspartat und Serin und spaltet bevorzugt nach einem Aspartatrest in der P1-Position. Der zu spaltende Aspartatrest interagiert dabei mit einem Argininrest in der Bindungstasche des Enzyms. GzmB ist im Allgemeinen bei neutralem pH aktiv und ist daher in den sauren CTL-Granula funktionell inaktiv. Zudem wird das Enzym in den Granula durch Bindung an Serglycin inaktiviert, um eine Apoptose zytotoxischer T-Zellen zu vermeiden. Initial liegt GzmB als inaktives Proenzym (Zymogen) mit einer zusätzlichen N-terminalen Peptidsequenz vor, die durch Cathepsin C durch Abspaltung von zwei Aminosäuren entfernt werden kann. GzmB kann auch durch Cathepsin H aktiviert werden.

Freisetzung und Aufnahme

GzmB wird zusammen mit Perforin freigesetzt; Perforin mit einem Radius von 5,5 nm kann durch Porenbildung in die Plasmamembran einer Zielzelle inserieren. GzmB weist einen kleineren Stokes-Radius (2,5 nm) als Perforin auf und kann daher durch die Perforin-Pore in die zu zerstörende Zielzelle gelangen. Alternativ bindet GzmB nach der Freisetzung an negativ geladene, Heparansulfat-haltige Rezeptoren auf der Zielzelle und wird endozytiert. Anschließend rupturieren die Vesikel, die das Enzym intrazellulär transportieren, und setzen GzmB im Zytoplasma frei, wo es auf seine Substrate trifft. Hsp-70 unterstützt ebenfalls den Eintritt von GzmB. Es wird zudem vorgeschlagen, dass GzmB in eine Zielzelle gelangt, indem es zunächst sein gebundenes Serglycin gegen negative Phospholipide in der Plasmamembran der Zielzelle austauscht und der Eintritt anschließend über den weniger selektiven Prozess der absorptiven Pinozytose erfolgt.

Durch Granzyme B vermittelte Apoptose

GzmB kann nach Eintritt in die Zielzelle die Caspasen 8 und 10 spalten und die Initiator-/Effektor-Caspasen 3 und 7 aktivieren, die Apoptose auslösen. Caspase 7 ist am empfindlichsten gegenüber GzmB; die Caspasen 3, 8 und 10 werden zunächst nur zu intermediären Fragmenten gespalten und benötigen zusätzliche Spaltungen zur vollständigen Aktivierung. GzmB kann BID spalten, was eine Oligomerisierung von BAX/BAK auslöst und die Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien bewirkt; außerdem kann es ICAD spalten, was zu DNA-Fragmentierung und dem für Apoptose typischen „Laddering“-Muster führt. GzmB besitzt potenziell über 300 Substrate und kann Mcl-1 in der äußeren Mitochondrienmembran abbauen, wodurch dessen Hemmung von Bim aufgehoben wird; dies stimuliert die Oligomerisierung von BAX/BAK, die Permeabilisierung der Mitochondrienmembran und Apoptose. Das Hs-1-assoziierte Protein X-1 kann ebenfalls durch GzmB gespalten werden, um die mitochondriale Polarisation zu erleichtern. GzmB kann Zelltod auch durch die Erzeugung zytotoxischer Spiegel mitochondrialer reaktiver Sauerstoffspezies vermitteln. Es wird angenommen, dass caspaseunabhängige Zelltodwege in der Lage sind, Viren zu überwinden, die Caspasen inhibieren und Apoptose verhindern.

Zielstrukturen

Viele Substrate von GzmB sind im Zellkern lokalisiert. Poly(ADP-Ribose)-Polymerase und DNA-Proteinkinase können durch GzmB gespalten werden, um DNA-Reparatur und retrovirale DNA-Integration zu blockieren. Nucleophosmin, Topoisomerase 1 und Nucleolin können ebenfalls durch GzmB abgebaut werden, um die virale Replikation zu verhindern. ICP4, ein essenzielles Protein des HSV-1-Virus, das für die Gen-Transaktivierung genutzt wird, sowie ein Protein des mitotischen Spindelapparats können gespalten werden, um die Mitose zu verhindern. GzmB kann zudem ein DNA-bindendes Protein zunächst in ein 50-kDa-Fragment und anschließend indirekt über die von ihm aktivierten Caspasen in eine zusätzliche 60-kDa-Einheit spalten. Darüber hinaus kann Granzyme B zahlreiche Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) wie Fibronectin, Vitronectin und Aggrecan degradieren; diese Spaltungen können wiederum durch Anoikis Zelltod auslösen und Alarmins aus der ECM freisetzen, was Entzündungen induziert. Von Basophilen sezerniertes GzmB degradiert zudem endotheliale Zell-Zell-Kontakte, wodurch die Extravasation zu Entzündungsherden ermöglicht wird. Die Spaltung von Vitronectin an der RGD-Integrin-Bindungsstelle kann Signalwege des Zellwachstums unterbrechen; der Abbau von Laminin und Fibronectin stört die Anheftung und den Crosstalk an der dermo-epidermalen Junktionszone, während die Zerstörung von Decorin durch GzmB zu Kollagendesorganisation, Hautverdünnung und Alterung führt. Keratinozyten können nach Exposition gegenüber UVA und UVB GzmB exprimieren, was mit Photoaging der Haut assoziiert ist. Die Spaltung des von-Willebrand-Faktors bzw. von Plasminogen hemmt die Thrombozytenaggregation bzw. erzeugt ein Angiostatin-Fragment, das die Angiogenese verhindert. Die Spaltung von Fibronectinen und Vitronectinen verzögert die Bildung einer provisorischen Matrix und beeinträchtigt dadurch die Wundheilung.

Rollen bei Erkrankungen

GzmB liegt im Blutplasma normalerweise in einer Konzentration von 20 bis etwa 40 pg/mL vor und behält nahezu 70 % seiner Aktivität. Erhöhte GzmB-Konzentrationen stehen mit einer Reihe von Krankheitszuständen in Zusammenhang. GzmB erzeugt Autoantigene, indem es in ungeordneten Regionen und Linker-Regionen von Antigenen spaltet und dadurch neue Epitope exponiert, was die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen begünstigt. Die Freisetzung von GzmB zusammen mit Perforin aus CD8-T-Zellen verursacht zudem Herz- und Nierentransplantatabstoßung durch Abtötung allogener Endothelzellen. Die durch T-Zellen und GzmB vermittelte Zerstörung insulinproduzierender β-Zellen in den Langerhans-Inseln trägt zu Typ-1-Diabetes bei. GzmB vermittelt außerdem den Zelltod nach Rückenmarksverletzungen und wird bei rheumatoider Arthritis in erhöhten Spiegeln gefunden. Von NK- und T-Zellen sezerniertes GzmB trägt zur Apoptose bronchialer Epithelzellen bei und verursacht dadurch eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD). Die Destabilisierung und Remodellierung der Matrix durch GzmB wird mit der Pathogenese von Asthma in Verbindung gebracht. Vitiligo, Kontaktdermatitis, Lichen sclerosus und Lichen planus können durch GzmB infolge der Abtötung von Melanozyten und seiner Überexpression begünstigt werden. Zytotoxische Zellen, die GzmB exprimieren, stehen in enger Beziehung zu Haarfollikeln, was eine mögliche Rolle bei Haarausfall nahelegt. Die ECM-remodellierenden Eigenschaften von GzmB wurden zudem mit dem linksventrikulären Remodeling in Verbindung gebracht, wodurch das nachfolgende Risiko eines Myokardinfarkts steigt.