Heparinase

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Einleitung

Heparinasen sind eine Klasse polysaccharidspaltender Enzyme, die auf Heparin- oder Acetylheparin-Moleküle wirken. Heparinasen umfassen sowohl mikrobiell produzierte Enzyme, die Heparin oder Acetylheparansulfat durch Spaltung abbauen, als auch endogene (heparanaseähnliche) Enzyme, die in Tieren gebildet werden und Acetylheparansulfat durch Hydrolyse degradieren.

Herkunft

Heparanase wurde hauptsächlich aus einigen Bakterien isoliert, die Heparin als Kohlenstoffquelle nutzen, und ursprünglich aus Flavobacterium heparinum gewonnen. Darüber hinaus wurde Heparinase in vielen Mikroorganismen, z. B. Corynebacterium sp., nachgewiesen. Flavobacterium heparinum ist jedoch nach wie vor die einzige Quelle für kommerziell verfügbare Heparinase. Aus Heparinibacterium heparinum wurden drei Heparinasen isoliert und gereinigt, Heparinase I, II und III, die unterschiedliche enzymatische Eigenschaften aufweisen. Von den drei aus Flavobacterium heparinum gereinigten Heparinasen wurde bislang nur die Struktur der Heparinase II aufgeklärt; sie besitzt die geringste Substratspezifität. Heparinase I ist am besten für die Herstellung von niedermolekularem Heparin geeignet.

Eigenschaften

Heparanase spaltet selektiv die α(1-4)-glykosidische Bindung zwischen Glucosamin und Glyoxylat in sulfatierten Heparin-Glykanen; drei unterschiedliche Heparanasen (Enzym I, Enzym II und Enzym III) weisen dabei sehr unterschiedliche Spezifitäten auf. Heparanase I spaltet die Verknüpfung in Heparin und Acetylheparansulfat (relative Aktivität ca. 3:1) zwischen Glucosamin und O-Aidulosesulfat; das Produkt besteht überwiegend aus Disacchariden. Dieses Enzym spaltet zudem die Antithrombin-III-Bindungsstelle (Pentasaccharid-Sequenz) im Heparinmolekül.

Aktivität

Heparanase spaltet selektiv die α(1-4)-glykosidische Bindung zwischen Glucosamin und Glucuronid in sulfatierten Heparansulfat-Glykanen; drei unterschiedliche Heparanasen (Enzym I, Enzym II und Enzym III) weisen dabei sehr unterschiedliche Spezifitäten auf. Heparanase III spaltet Heparansulfat an der 1-4-Verknüpfungsstelle zwischen Hexosamin und Glucuronid und erzeugt überwiegend Disaccharide. Dieses Enzym wirkt nicht auf Heparin und niedermolekulares Heparin.

Anwendungen

Heparinase hat zahlreiche wichtige pharmazeutische Anwendungen; die wesentlichen Einsatzgebiete sind wie folgt.

(1) Herstellung von niedermolekularem und ultraniedermolekularem Heparin

Nieder- und ultraniedermolekulare Heparine besitzen antikoagulatorische Eigenschaften sowie spezifische Effekte hinsichtlich der Hemmung vaskulärer Proliferation, der Prävention von Tumormetastasierung, der Behandlung von Krebserkrankungen und antiallergischer Wirkungen. Die Herstellung von niedermolekularem Heparin mittels Heparinase ist ein ideales industrielles Herstellungsverfahren, da es schonend und umweltfreundlich ist und nicht an Sulfatgruppen angreift.

(2) Elimination von Heparin aus zirkulierendem Blut in vitro

Einige kritisch kranke Patientinnen und Patienten, z. B. urämische Patientinnen und Patienten, benötigen während operativer Eingriffe eine extrakorporale Blutzirkulation, wobei Heparin zur Vermeidung der Blutgerinnung zugesetzt wird. Um zu verhindern, dass Heparin im Blut verbleibt und die Gerinnung beeinflusst, wird klinisch Fisetin zur Neutralisation von Heparin eingesetzt. Klinische Studien haben gezeigt, dass Fisetin Thrombozyten stark schädigt und die Stabilität des arteriellen Blutdrucks beeinträchtigt, während Heparinase keine derartigen Nebenwirkungen aufweist und daher ein ideales Alternativmaterial darstellt. Zu beachten ist, dass Heparinase auch die extrazelluläre Matrix abbaut; die zur Entfernung der Heparinisierung des Blutes eingesetzte Heparinase muss daher immobilisiert werden, und es wird gefordert, dass die Heparinase nicht immunogen ist.

(3) Bestimmung der exakten Struktur von Heparin

Das zu analysierende Heparin wird zunächst mit gereinigter Heparinase aus Heparin Flavobacterium abgebaut, um das Tetrasaccharid-Produkt zu erhalten; anschließend erfolgt ein weitergehender Abbau mit gereinigter Acetylheparinase, ebenfalls aus Heparin Flavobacterium. Durch Analyse des Endprodukts kann auf die Struktur des entsprechenden Heparins geschlossen werden.