Histamin-Dehydrogenase

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Einleitung

Histamin ist ein essenzielles biogenes Amin in Prokaryoten sowie in Geweben von Tieren und Pflanzen. Beim Menschen wirkt Histamin als Neurotransmitter, vermittelt allergische Reaktionen, spielt eine Rolle bei der Zellproliferation und bei der Signalübertragung zur Freisetzung von Magensäure in den Magen. Histaminrezeptoren sind Zielstrukturen von Arzneimitteln zur Behandlung von Allergien und erhöhter Magensäure, jedoch liegen nur wenige strukturelle Informationen zu diesen Proteinen vor. Obwohl die Histaminoxidase aus Arthrobacter globiformis als Histaminsensor eingesetzt wurde, zeigte sich später, dass das Enzym gegenüber Dopamin und Tyramin empfindlicher ist als gegenüber Histamin.

Histamindehydrogenase (HADH) kann aus Kulturen von Nocardiodes simplex isoliert werden, die mit Histamin als alleiniger Stickstoffquelle kultiviert wurden. Das Enzym ist ein Homodimer mit einer Untereinheit von ca. 76 kDa, die die oxidative Desaminierung von Histamin zu Imidazolacetaldehyd katalysiert (Schema 1). Dabei weist das Enzym eine bemerkenswerte Selektivität für Histamin auf und zeigt somit ein hohes Potenzial für den Einsatz in Biosensoren. HADH wurde ursprünglich als chinonhaltige Amindehydrogenase klassifiziert. Spätere Untersuchungen zeigten, dass HADH ein Homolog von TMADH ist; zudem weist die Dimethylamindehydrogenase (DMADH) aus M. methylotrophus 40 % Sequenzidentität und 56 % Sequenzähnlichkeit mit beiden Proteinen auf.

Schema 1 (Reed, T.; et al. 2010)

Das ungewöhnliche 6‑S‑Cysteinyl‑FMN (6‑S‑Cys‑FMN) sowie ein [4Fe‑4S]-Cluster fungieren als Kofaktoren in dieser kleinen Proteinfamilie. Die Oxidation von Histamin durch HADH hinterlässt das Flavin in der reduzierten Form 6‑S‑Cys‑FMN_red, die durch eine schrittweise Elektronentransferreaktion über den [4Fe‑4S]-Cluster entweder zu einem Mediator, wie Phenazinemethosulfat, oder – bei TMADH – reoxidiert wird. Wird HADH oder TMADH unter Single‑Turnover‑Bedingungen reduziert, kommt es zu einer Disproportionierungsreaktion zwischen 6‑S‑Cys‑FMN_red und [4Fe‑4S]²⁺, wobei ein Semichinon, 6‑S‑Cys‑FMN_sq, und [4Fe‑4S]⁺ entstehen (Schema 2). In TMADH bilden die beiden Spins einen Triplettzustand, der mittels EPR als starkes Halb‑Feld‑Signal detektiert wird. Unter Steady‑State‑Bedingungen bei hohen Substratkonzentrationen wird 6‑S‑Cys‑FMN_sq durch die Bindung eines Substratkations stabilisiert und kann nicht mehr durch [4Fe‑4S] oxidiert werden, was zu einer Substratinhibition führt.

Schema 2 (Reed, T.; et al. 2010)

Die Gesamtstruktur von HADH

HADH ist ein Homodimer mit zwei Molekülen pro asymmetrischer Einheit, und seine Gesamtstruktur ist der nativen TMADH sehr ähnlich. HADH in voller Länge umfasst 690 Aminosäurereste. Jedes Molekül enthält 6‑S‑Cys‑FMN und [4Fe‑4S] als redoxaktive Kofaktoren; zudem ist pro Molekül ein einzelnes ADP vorhanden. Jede Untereinheit besteht aus einer großen Domäne (Reste 7–385), einer mittleren Domäne (Reste 386–491 und 622–690) und einer kleinen Domäne (Reste 492–621). Die große Domäne enthält ein N‑terminales Triosephosphatisomerase‑Fass (TIM‑Barrel), das die häufigste Tertiärfaltung in Proteinkristallstrukturen darstellt. 6‑S‑Cys‑FMN befindet sich an der Öffnung des Fasses, umgeben von Alpha‑Helices und ausgeprägten Schleifen am Ende der Beta‑Stränge des Fasses, die 6‑S‑Cys‑FMN abdecken und einbetten. Der [4Fe‑4S]-Cluster wird durch vier Cys‑Reste koordiniert (Cys³⁴⁸, Cys³⁵¹, Cys³⁵⁴ und Cys³⁶⁶). Wie anhand des Sequenzalignments vorhergesagt, bindet jedes Proteinmolekül ein ADP‑Molekül, das in der mittleren Domäne lokalisiert ist. ADP ist an der Oberfläche exponiert, nahe der Grenzfläche zwischen kleiner und mittlerer Domäne, jedoch nicht kovalent verknüpft.

Die Elektronendichte von 6‑S‑Cys‑FMN ist sehr eindeutig und konsistent mit einem vollständig flavinylierten Enzym. Die mittlere Belegung (Occupancy) von FMN in TMADH (PDB‑Code 1DJN) wird auf 0,55 geschätzt. Auf Basis der Elektronendichte wird vermutet, dass der Isoalloxazinring von 6‑S‑Cys‑FMN in rekombinanter HADH nicht planar ist, sondern – wie bei rekombinanter TMADH gezeigt – eine „Butterfly‑Bend“-Konformation aufweist, zentriert um die Positionen N5 und N10. Obwohl die für diese Butterfly‑Bend verantwortlichen Faktoren unbekannt sind, konnte gezeigt werden, dass die Ausbildung der Cysteinyl‑Querverknüpfung die Biegung nicht verursacht.

Abbildung 1. Übersicht über die Struktur der rekombinanten HADH (Reed, T.; et al. 2010)