Histamin-Dehydrogenase

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Einführung

Histamin ist ein essentielles biogenes Amin in Prokaryoten sowie in Geweben von Tieren und Pflanzen. Bei Menschen wirkt Histamin als Neurotransmitter, vermittelt allergische Reaktionen, spielt eine Rolle bei der Zellproliferation und signalisiert die Freisetzung von Magensäure in den Magen. Histaminrezeptoren sind Ziele für Medikamente, die Allergien und Magenübersäuerung behandeln, aber es sind nur wenige strukturelle Informationen über diese Proteine verfügbar. Obwohl Histaminoxidase aus Arthrobacter globiformis als Histaminsensor verwendet wurde, stellte sich später heraus, dass das Enzym empfindlicher auf Dopamin und Tyramin reagiert als auf Histamin.

Histamin-Dehydrogenase (HADH) kann aus Kulturen von Nocardiodes simplex isoliert werden, die auf Histamin als einzige Stickstoffquelle gewachsen sind. Das Enzym ist ein Homodimer einer ∼76 kDa großen Untereinheit, die für die katalytische oxidative Deaminierung von Histamin verantwortlich ist, um Imidazol-Acetaldehyd (Schema 1) zu erzeugen, wobei das Enzym eine bemerkenswerte Selektivität für Histamin aufweist und somit großes Potenzial für den Einsatz in Biosensoren zeigt. HADH wurde ursprünglich als ein quinonhaltiges Amin-Dehydrogenase klassifiziert. Spätere Studien zeigten, dass HADH ein Homolog von TMADH ist und dass Dimethylamin-Dehydrogenase (DMADH) aus M. methylotrophus 40% Sequenzidentität und 56% Ähnlichkeit mit beiden Proteinen teilt.

Schema 1 (Reed, T.; et al. 2010)

Das ungewöhnliche 6-S-Cysteinyl-FMN oder 6-S-Cys-FMN und [4Fe-4S] fungieren als Kofaktoren in dieser kleinen Proteinfamilie. Die Oxidation von Histamin durch HADH hinterlässt das Flavin in seiner reduzierten Form, 6-S-Cys-FMN_red, das durch eine schrittweise Elektronentransferreaktion über das [4Fe-4S] entweder zu einem Mediator, wie Phenazinemethosulfat, oder in TMADH reoxidiert wird. Wenn HADH oder TMADH unter Einzel-Umsatzbedingungen abnimmt, tritt eine Disproportionierungsreaktion zwischen 6-S-Cys-FMN_red und [4Fe-4S]²⁺ auf, um ein Semiquinon, 6-S-Cys-FMN_sq, und [4Fe-4S]⁺ zu erzeugen (Schema 2). In TMADH bilden die beiden Spins ein Triplett, das durch EPR als starkes Halbfeldsignal detektiert wird. Unter stationären Bedingungen bei hohen Substratkonzentrationen wird das 6-S-Cys-FMN_sq durch die Bindung eines Substratkations stabilisiert und kann nicht mehr durch [4Fe-4S] oxidiert werden, was zu einer Substratinhibition führt.

Schema 2 (Reed, T.; et al. 2010)

Die Gesamtstruktur von HADH

HADH ist ein Homodimer, das zwei Moleküle pro asymmetrischer Einheit enthält, und seine Gesamtstruktur ähnelt sehr der von nativem TMADH. Das vollständige HADH enthält 690 Reste. Jedes Molekül enthält 6-S-Cys-FMN und [4Fe-4S] als redoxaktive Kofaktoren, und pro Molekül ist auch ein einzelnes ADP vorhanden. Jede Untereinheit besteht aus einem großen Bereich (Reste 7-385), einem mittleren Bereich (Reste 386-491 und 622-690) und einem kleinen Bereich (Reste 492-621). Der große Bereich enthält ein N-terminales Triosephosphat-Isomerase-Fass, das die häufigste tertiäre Faltung in Protein-Kristallstrukturen darstellt. Das 6-S-Cys-FMN befindet sich am Öffnungsbereich des Fasses, umgeben von Alpha-Helices und großen Auslenkungen am Ende des Beta-Strangs des Fasses, um das 6-S-Cys-FMN zu bedecken und zu verbergen. Der [4Fe-4S]-Cluster ist an vier Cys-Reste (Cys³⁴⁸, Cys³⁵¹, Cys³⁵⁴ und Cys³⁶⁶) koordiniert. Wie aus der Sequenzanpassung vorhergesagt, bindet jedes Proteinmolekül an ein ADP-Molekül, das sich im mittleren Bereich befindet. ADP ist an der Oberfläche exponiert, nahe der Schnittstelle zwischen dem kleinen und dem mittleren Bereich, ist jedoch nicht kovalent gebunden.

Die Elektronendichte des 6-S-Cys-FMN ist sehr klar und konsistent mit dem vollständig flavinylisierten Enzym. Die durchschnittliche Belegung von FMN in TMADH (PDB-Code 1DJN) wird auf 0,55 geschätzt. Laut der Elektronendichte wird spekuliert, dass der Isoalloxazinring von 6-S-Cys-FMN in rekombinantem HADH nicht planar ist, sondern sich in einer "Schmetterlingsbiegung" befindet, die sich auf den Positionen N5 und N10 zentriert, wie in rekombinantem TMADH gezeigt. Obwohl die Faktoren, die für diese Schmetterlingsbiegung verantwortlich sind, unbekannt sind, wurde gezeigt, dass die Bildung von Cysteinquervernetzungen nicht die Biegung verursacht.

Abbildung 1. Übersicht über die Struktur von rekombinantem HADH (Reed, T.; et al. 2010)