IGPD

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Einleitung

Histidin ist ein essenzieller Nahrungsbestandteil für Tiere und wird von Pflanzen und Mikroorganismen de novo synthetisiert. Daher stellen biosynthetische Signalwege potenzielle Zielstrukturen für die Herbizidentwicklung dar. Die Synthese von Histidin aus dem Vorläufer Phosphoribosylpyrophosphat ist ein komplexer Prozess, der durch neun Enzyme katalysiert wird. Die meisten Zwischenprodukte dieses Signalwegs sind instabil, was strukturelle und mechanistische Untersuchungen der einzelnen Schritte erschwert. Die Imidazolglycerolphosphat-Dehydratase (IGPD) katalysiert den sechsten Schritt des Signalwegs und ist für die Dehydratisierung von Imidazolglycerolphosphat (IGP) zu Imidazolacetolphosphat verantwortlich. Mehrere IGPD-Inhibitoren wurden identifiziert, darunter Derivate der Triazolpropylphosphonsäure. Von IGPD katalysierte Reaktionen könnten einen ungewöhnlichen molekularen Mechanismus aufweisen, da das abgehende C-2-Wasserstoffatom von IGP nicht sauer ist. Im Gegensatz dazu ist das abgehende Wasserstoffatom bei den meisten enzymkatalysierten Dehydratisierungen aufgrund einer benachbarten Carbonyl- oder Iminogruppe relativ sauer.

IGPDs in Pilzen, Pflanzen, Archaeen und einigen Eubakterien sind monofunktional. Andere Eubakterien kodieren bifunktionale Enzyme, bei denen IGPD mit dem vorletzten Enzym der Histidinbiosynthese, der Histidinphosphat-Phosphatase, fusioniert ist. Metallionen sind für die IGPD-Katalyse entscheidend, der Mechanismus ist jedoch weiterhin unklar. In Abwesenheit von Metallen liegen pflanzliche und pilzliche IGPDs als stabile, inaktive Trimere vor. Mn²⁺ induziert eine Aggregation zu einer katalytisch aktiven Form, die offenbar ein 24-Mer ist. Vorläufige Studien deuten darauf hin, dass Hefe-IGPD als 24-Mer mit molekularer oktaedrischer Symmetrie kristallisiert, was mit dem aggregierten Zustand in Lösung übereinstimmt. Die Struktur konnte jedoch nicht bestimmt werden, da die Beugungsqualität der kubischen Kristalle zu gering war.

IGPD-Faltung: Genduplikation und einzigartige Anordnung eines seltenen Strukturmotivs

Das IGPD-Polypeptid bildet eine einzelne Domäne, bestehend aus einem Bündel von vier α-Helices, das zwischen zwei viersträngigen β-Faltblättern (β1-β2-β4-β3 und β5-β6-β8-β7) eingebettet ist. Die Faltung weist eine interne Wiederholung auf. Das Halbdomänenmotiv umfasst einen seltenen linkshändigen Crossover. Die Sequenzen der Aminosäurereste 1–93 und 94–202 der IGPD aus F. neoformans sind zu 19 % identisch. Die am stärksten konservierten Merkmale der internen Wiederholung sind die (D/N)XHHXXE-Motive in den Schleifen β3-α1 (Reste 69–75) und β8-α4 (Reste 165–171). Die Duplikation von Sequenz- und Strukturelementen spricht für das Vorliegen einer Genduplikation in der Evolution der IGPD. Genduplikation ist ein wiederkehrendes Thema bei Enzymen der Histidinbiosynthese. Die Enzyme, die die ersten beiden Schritte der IGPD-Dehydratisierungsreaktion katalysieren, die Phosphoribosylformimino-5-aminoimidazolcarboxamid-Ribotid-Isomerase und die Imidazolglycerolphosphat-Synthase, weisen ebenfalls interne Wiederholungseigenschaften auf und gelten als durch ähnliche Genduplikationsmechanismen funktionell entstanden sowie aus Fusionsereignissen hervorgegangen. Diese Enzyme sind Homologe, stehen jedoch nicht in Beziehung zu IGPD.

Auf Basis einer Topologiesuche in der Protein Data Bank fand die Strukturdatenbank kein Protein mit einer IGPD-ähnlichen Faltung. Allerdings besitzen einige Proteine Subdomänen mit Topologien, die mit den IGPD-Halbdomänen identisch sind. Diese Faltung wurde erstmals in einigen Nukleinsäure-bindenden Proteinen identifiziert. Kürzlich wurde die Halbdomäne in mehreren weiteren Proteinen gefunden und stellt ein konserviertes Strukturmerkmal der GHMP-Kinase-Superfamilie dar. Die N-terminale oder C-terminale Halbdomäne der IGPD teilt mit diesen Proteinen eine Sequenzidentität von 6–12 %, was auf eine sehr alte evolutionäre Beziehung zwischen ihnen hindeutet.

Abbildung 1. Polypeptidfaltung von IGPD (Sinha, S.C.; et al. 2004)

Quartärstruktur im Kristall

IGPD kristallisierte als Trimer, was seiner Quartärstruktur in metallfreier Lösung entspricht. Trotz der Anwesenheit von Mn²⁺ in der Kristallisationslösung ist die trimerische Aggregation konsistent mit dem Fehlen gebundenen Mn²⁺ in der Kristallstruktur. Aufgrund der großen Größe und des hydrophoben Charakters der Grenzfläche schließen wir, dass das kristalline Trimer dem Trimer in Lösung entspricht. Etwa 15 % der Oberfläche jedes Monomers sind in der Untereinheitengrenzfläche vergraben. Das innere C-terminale β-Faltblatt ist aufgrund umfangreicher Untereinheitenkontakte stärker geordnet als das äußere N-terminale β-Faltblatt. Die hydrophoben Seitenketten (Leu-179, Tyr-98, Tyr-100, Tyr-102, Ala-103, Pro-104, Leu-109, Val-113, Ile-161, Met-183) sowie der aliphatische Anteil von Arg-182, Lys-96 und Arg-111 bilden einen hydrophoben Kern zwischen den Untereinheiten. Die Unterseite des Trimers ist positiv geladen; die intersubunitären Kontakte an dieser Oberfläche umfassen die Seitenketten von Tyr-98 und Lys-175 sowie sulfatvermittelte Salzbrücken zwischen Arg-97 einer Untereinheit und Lys-175 sowie His-53 einer anderen. Auf der Oberseite des Trimers befindet sich eine konische polare Vertiefung, die mit 18 geordneten Wassermolekülen gefüllt ist.

Abbildung 2. Quartärstruktur von IGPD (Sinha, S.C.; et al. 2004)