IGPD

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Einführung

Histidin ist ein essentielles Nahrungsnutrient für Tiere, das de novo von Pflanzen und Mikroorganismen synthetisiert wird. Daher sind biosynthetische Wege potenzielle Ziele für die Entwicklung von Herbiziden. Die Synthese von Histidin aus dem Vorläufer Phosphoribosylpyrophosphat ist ein komplexer Prozess, der von neun Enzymen katalysiert wird. Die meisten der Zwischenprodukte in diesem Weg sind instabil, was die strukturellen und mechanistischen Studien der einzelnen Schritte erschwert. Imidazolglycerol-phosphat-Dehydratase (IGPD) katalysiert den sechsten Schritt des Weges und ist verantwortlich für die Dehydratisierung von Imidazolglycerolphosphat (IGP) zu Imidazolacetolphosphat. Mehrere IGPD-Inhibitoren wurden identifiziert, darunter Derivate der Triazolpropylphosphonsäure. Die von IGPD katalysierten Reaktionen könnten einen ungewöhnlichen molekularen Mechanismus aufweisen, da das abgehende C-2-Wasserstoffatom von IGP nicht sauer ist. Im Gegensatz dazu ist das abgehende Wasserstoffatom in den meisten enzymkatalysierten Dehydratisierungen relativ sauer aufgrund einer benachbarten Carbonyl- oder Imin-Gruppe.

IGPDs in Pilzen, Pflanzen, Archaeen und einigen Eubakterien sind monofunktional. Andere Eubakterien kodieren bifunktionale Enzyme, bei denen IGPD mit dem vorletzten Enzym in der Histidinsynthese, Histidin-Phosphat-Phosphatase, fusioniert ist. Metallionen sind entscheidend für die IGPD-Katalyse, aber der Mechanismus bleibt unklar. In Abwesenheit von Metallen sind pflanzliche und pilzliche IGPDs stabile inaktive Trimere. Mn²⁺ induziert die Aggregation zu einer katalytisch aktiven Form, die anscheinend ein 24-mer ist. Vorläufige Studien zeigen, dass Hefe-IGPD als 24-mer mit molekularer oktahedraler Symmetrie kristallisiert, was mit seinem aggregierten Zustand in Lösung übereinstimmt. Aber die Struktur konnte nicht bestimmt werden, da die Beugung der kubischen Kristalle zu schlecht war.

IGPD-Faltung: Gen-Duplikation und einzigartige Anordnung eines seltenen strukturellen Motivs

Das IGPD-Polypeptid bildet eine einzelne Domäne, die aus einem Bündel von vier α-Helices besteht, die zwischen viersträngigen β-Faltblättern (β1-β2-β4-β3 und β5-β6-β8-β7) eingeklemmt sind. Die Faltung weist ein internes Wiederholungsmotiv auf. Das Halbdomänenmotiv umfasst einen seltenen linkshändigen Überkreuzung. Die Sequenzen der Reste 1-93 und 94-202 von F. neoformans IGPD sind zu 19 % identisch. Die am stärksten konservierten Merkmale der internen Wiederholung sind die (D/N)XHHXXE-Motive in den Schleifen β3-α1 (Reste 69-75) und β8-α4 (Reste 165-171). Die Duplikation von Sequenz- und Strukturelementen deutet auf das Vorhandensein von Gen-Duplikation in der Evolution von IGPD hin. Gen-Duplikation ist ein wiederkehrendes Thema bei Histidinsyntheseenzymen. Die Enzyme, die die ersten beiden Schritte der IGPD-Dehydratisierungsreaktion katalysieren, Phosphoribosylformimino-5-aminoimidazolcarboxamid-Ribotide-Isomerase und Imidazolglycerolphosphat-Synthase, weisen ebenfalls Eigenschaften interner Wiederholungen auf und werden als durch ähnliche Gen-Duplikation entstanden angesehen, die aus Fusionsereignissen hervorgegangen sind. Diese Enzyme sind Homologe, aber nicht mit IGPD verwandt.

Basierend auf einer Topologiesuche in der Protein-Datenbank fand die Struktur-Datenbank kein Protein mit einer Faltung wie IGPD. Einige Proteine haben jedoch Subdomänen mit Topologien, die identisch mit den IGPD-Halbdomen sind.  Diese Faltung wurde erstmals in einigen Nukleinsäure-bindenden Proteinen identifiziert. Kürzlich wurde die Halbdomäne in mehreren anderen Proteinen gefunden und ist ein konserviertes strukturelles Merkmal der GHMP-Kinase-Superfamilie. Die N-terminalen oder C-terminalen Halbdomänen von IGPD teilen 6-12 % Sequenzidentität mit irgendeinem dieser Proteine, was auf eine sehr alte Beziehung zwischen ihnen hindeutet.

Abbildung 1. Polypeptid-Faltung von IGPD (Sinha, S.C.; et al. 2004)

Quartärstruktur im Kristall

IGPD kristallisierte als Trimer, was seine quartäre Struktur in metallfreier Lösung ist. Trotz der Anwesenheit von Mn²⁺ in der Kristallisationslösung ist die trimerische Aggregation mit dem Fehlen von gebundenem Mn²⁺ in der Kristallstruktur konsistent. Aufgrund der großen Größe und des hydrophoben Charakters der Schnittstelle schließen wir, dass das kristalline Trimer dem Lösungstrimer entspricht. Etwa 15 % der Oberfläche jedes Monomers sind in der Untereinheitenschnittstelle verborgen. Das innere C-terminale β-Faltblatt ist geordneter als das äußere N-terminale β-Faltblatt aufgrund umfangreicher Untereinheitkontakte. Die hydrophoben Seitenketten (Leu-179, Tyr-98, Tyr-100, Tyr-102, Ala-103, Pro-104, Leu-109, Val-113, Ile-161, Met-183) und die aliphatische Gruppe von Arg-182, Lys-96 und Arg-111 bilden einen hydrophoben Kern zwischen den Untereinheiten. Die untere Oberfläche des Trimers ist positiv geladen, und die Interaktionen zwischen den Untereinheiten an dieser Oberfläche umfassen die Seitenketten von Tyr-98 und Lys-175 sowie sulfatvermittelte Salzbrücken zwischen Arg-97 einer Untereinheit und Lys-175 und His-53 einer anderen. Es gibt eine konische polare Vertiefung auf der oberen Oberfläche des Trimers, die mit 18 geordneten Wassermolekülen gefüllt ist.

Abbildung 2. IGPD-Quartärstruktur (Sinha, S.C.; et al. 2004)