Anorganische Pyrophosphatase

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Einleitung

Anorganische Pyrophosphatasen (PPasen) sind essenzielle Enzyme, die eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der zellulären Konzentration von anorganischem Pyrophosphat (PPi) spielen, welches biosynthetische Reaktionen wie die Nukleinsäure- und Proteinsynthese antreibt. PPi entsteht in großen Mengen als Nebenprodukt biosynthetischer Reaktionen, und seine Konzentration beeinflusst die intrazelluläre Homöostase dieser physiologischen Prozesse. PPasen katalysieren die einfachste Phosphoryltransferreaktion, die Hydrolyse eines symmetrischen Pyrophosphat-(PPi-)Substrats zu zwei Molekülen anorganischen Phosphats (Pi). Von den vier unterschiedlichen Klassen der PPasen (membranintegrale M‑PPasen sowie lösliche PPasen der Familien I, II und III) sind S‑PPasen der Familie III bislang nicht umfassend charakterisiert und kommen nur in wenigen bakteriellen Spezies vor. Die übrigen drei PPase-Familien stellen somit Enzymlösungen dar, die primär oder ausschließlich der Pyrophosphatase-Katalyse gewidmet sind.

Gemeinsamkeiten und Unterschiede

Abhängig von Enzymfamilie, pH-Wert und PPi-Konzentration können für die Katalyse durch PPasen drei oder vier Metallionen erforderlich sein. Die Katalyse beruht auf der Aktivierung der Abgangsgruppe und der effizienten Generierung eines Nukleophils und verläuft ohne ein Enzym‑Phosphat‑Zwischenprodukt. Dies spricht dafür, dass die Katalyse vollständig innerhalb der anorganischen Metall‑Phosphat‑Komplexe erfolgt, wobei Proteinseitenketten überwiegend eine unterstützende Rolle einnehmen. Im Hinblick auf die Pyrophosphat-Hydrolyse bestehen die drei größten Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen in ihren unterschiedlichen Reaktionen auf zwei Inhibitoren – Fluorid und die Diphosphonate, insbesondere Aminomethylendiphosphonat (AMDP) – sowie in der bevorzugten Art des zweiwertigen Kations. Hinsichtlich der Katalyse sind M‑PPasen am langsamsten (kcat≈10s^-1), während PPasen der Familie I etwa um eine Größenordnung höher liegen (kcat≈200s^-1) und Enzyme der Familie II wiederum um eine Größenordnung höher als die Aktivität der Familie‑I‑Enzyme sind (kcat≈2000s^-1).

Lösliche PPasen, insbesondere Enzyme der Familie I, stellen aufgrund der Verfügbarkeit detaillierter struktureller und funktioneller Informationen eine besser verstandene Phosphotransferase dar. Die biologischen Funktionen der PPasen der Familien I und II sind identisch; ihr alleiniger Zweck besteht in der Entfernung von Pyrophosphat. Ihre Sequenzen und Strukturen sind jedoch nicht verwandt, und die Mechanismen scheinen unterschiedlich zu sein. Membranintegrale PPasen (M‑PPasen) unterscheiden sich deutlich von ihren löslichen Gegenstücken. M‑PPasen besitzen zudem ein breiteres biologisches Funktionsspektrum als lösliche PPasen, da sie eine Rolle für das Überleben von Pflanzen und Bakterien unter verschiedenen energiearmen Stressbedingungen spielen.

Tabelle 1. Ausgewählte kinetische Eigenschaften von PPasen und deren Inhibition durch F^- und AMDP

Struktur und Mechanismus löslicher Pyrophosphatasen

PPasen der Familie I, die erstmals 1952 kristallisiert wurden, sind umfassend untersucht worden, insbesondere PPasen aus Escherichia coli (EPPase) und Saccharomyces cerevisiae (YPPase). PPasen der Familie I kommen in allen Domänen des Lebens vor und falten sich zu einer kompakten Einzeldomänenstruktur mit einem konservierten, fünfsträngigen OB‑Fold‑β‑Barrel als Kern, wobei sich das aktive Zentrum an der Oberseite befindet. Eukaryotische Enzyme liegen üblicherweise als Dimere vor, während bakterielle Enzyme meist Hexamere bilden. Obwohl sich die Sequenzkonservierung in PPasen der Familie I kaum über die 20 geladenen und hydrophilen Aminosäurereste im aktiven Zentrum hinaus erstreckt, lassen sie sich zuverlässig anhand der konservierten D‑(S/G/N)‑D‑P‑ali‑D-ali‑ali‑Motive identifizieren (ali = C/I/L/M/V). Charakteristische Merkmale der Katalyse von PPasen der Familie I sind, dass alle freien Elektronenpaare im Substrat koordiniert werden und dass die PPi‑Hydrolyse über einen assoziativen Mechanismus abläuft, bei dem die elektrophile Phosphat‑Einheit von PPi durch Nukleophile aktivierter Wassermoleküle angegriffen wird.

Abbildung 1. Gegenüberstellung der Gesamt‑Ribbon‑Darstellungen der substratgebundenen Konformationen der Hefe‑PPase der Familie I (YPPase, links) (1E6A), der B. subtilis‑PPase der Familie II (BsPPase, Mitte) (2HAW) und der H⁺-pumpenden Mungbohnen‑PPase (VrPPase, rechts) (Kajander, T.; et al. 2013)

PPasen der Familie II kommen in bakteriellen und archaeellen Linien vor, insbesondere bei Bacilli und Clostridia, einschließlich mehrerer humanpathogener Spezies. PPasen der Familie II sind strukturell von PPasen der Familie I verschieden; die zweidomänigen Proteine dieser Homodimere gehören zur Phosphatase‑Superfamilie „DHH“, wobei DHH auf ein konserviertes Asp‑His‑His‑Motiv in der N‑terminalen Domäne verweist, das für die Spezifität der Metallionenbindung entscheidend ist. Das aktive Zentrum der PPasen der Familie II befindet sich zwischen den N‑terminalen DHH‑ und den C‑terminalen DHHA2‑Domänen. Wie oben erwähnt, zeigen PPasen der Familie II die höchste katalytische Aktivität in Gegenwart der Metallionen Mn²⁺ oder Co²⁺. Die Bindungs- und kinetischen Präferenzen für Übergangsmetalle lassen sich anhand der Architektur des aktiven Zentrums erklären.

Abbildung 2. Gegenüberstellung der hydrolytischen Zentren von YPPase (links), BsPPase (Mitte) und VrPPase (rechts) mit Hervorhebung der Unterschiede in der detaillierten Geometrie des aktiven Zentrums zwischen den drei Enzymen (Kajander, T.; et al. 2013)