Anorganische Pyrophosphatase

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Einführung

Inorganische Pyrophosphatasen (PPasen) sind essentielle Enzyme, die eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der zellulären Konzentration von anorganischem Pyrophosphat (PPi) spielen, welches biosynthetische Reaktionen wie die Synthese von Nukleinsäuren und Proteinen antreibt. PPi wird in großen Mengen als Nebenprodukt biosynthetischer Reaktionen gebildet, und seine Konzentration beeinflusst die intrazelluläre Homöostase dieser physiologischen Reaktionen. PPase katalysiert die einfachste Phosphoryltransferreaktion, die Hydrolyse eines symmetrischen Pyrophosphat (PPi)-Substrats zu zwei anorganischen Phosphat (Pi)-Molekülen. Von den vier verschiedenen Klassen von PPasen (membranintegrierte M-PPasen und lösliche Familie I, Familie II und Familie III PPasen) sind die Familie III S-PPasen nicht umfassend charakterisiert und kommen nur in wenigen Bakterienarten vor. Die anderen drei PPase-Familien stellen somit Enzymlösungen dar, die hauptsächlich oder ausschließlich der Katalyse von Pyrophosphatasen gewidmet sind.

Gemeinsamkeiten und Unterschiede

Je nach Enzymfamilie, pH-Wert und PPi-Konzentration können drei oder vier Metallionen für die Katalyse durch PPasen erforderlich sein. Die Katalyse basiert auf der Aktivierung der Abgangsgruppe und der effektiven Generierung von Nucleophilen und erfolgt in Abwesenheit eines Enzym-Phosphat-Intermediats. Dies deutet darauf hin, dass die Katalyse vollständig innerhalb der anorganischen Metallphosphatkäfige stattfindet, wobei die Seitenketten der Proteine hauptsächlich eine Hilfsfunktion übernehmen. In Bezug auf die Hydrolyse von Pyrophosphat sind die drei größten Unterschiede zwischen den verschiedenen Enzymen ihre unterschiedlichen Reaktionen auf zwei Inhibitoren: Fluorid und die Diphosphonate, insbesondere auf Aminomethylendiphosphonat (AMDP), sowie den gewünschten Typ des zweiwertigen Kations. Für die Katalyse sind M-PPasen die langsamsten (kcat≈10s^-1), während Familie I PPasen etwa eine Größenordnung höher sind (kcat≈200s^-1), und Familie II Enzyme eine Größenordnung höher als die Aktivität von Familie I Enzymen sind (kcat≈2000s^-1).

Lösliche PPasen, insbesondere Enzyme der Familie I, stellen eine besser verstandene Phosphotransferase dar, da detaillierte strukturelle und funktionale Informationen verfügbar sind. Die biologischen Funktionen von Familie I und Familie II PPasen sind identisch, ihr einziges Ziel ist es, Pyrophosphat zu entfernen. Aber ihre Sequenzen und Strukturen sind nicht verwandt, und die Mechanismen scheinen unterschiedlich zu sein. Membranintegrierte PPasen (M-PPasen) unterscheiden sich stark von ihren löslichen Gegenstücken. M-PPasen haben auch breitere biologische Funktionen als lösliche PPasen, da sie eine Rolle im Überleben von Pflanzen und Bakterien unter verschiedenen Niedrigenergie-Stressbedingungen spielen.

Tabelle 1. Ausgewählte kinetische Eigenschaften von PPasen und deren Hemmung durch F^- und AMDP

Struktur und Mechanismus der löslichen Pyrophosphatasen

Familie I PPasen, die erstmals 1952 kristallisiert wurden, sind umfassend untersucht worden, insbesondere PPasen aus Escherichia coli (EPPase) und Saccharomyces cerevisiae (YPPase). Familie I PPasen, die in allen Lebensreichen vorkommen, falten sich zu einer kompakten Ein-Domänen-Struktur mit einem konservierten fünfsträngigen OB-Faltblatt-β-Fass im Kern, wobei sich die aktive Stelle oben befindet. Eukaryotische Enzyme existieren normalerweise als Dimere, während bakterielle Enzyme normalerweise Hexamere sind. Obwohl die Sequenzkonservierung in Familie I PPasen kaum über die 20 geladenen und hydrophilen Reste in der aktiven Stelle hinausgeht, können sie zuverlässig durch die konservierten D-(S/G/N)-D-P-ali-D-ali-ali-Motive (ali = C/I/L/M/V) identifiziert werden. Die auffälligen Merkmale der Katalyse von Familie I PPasen sind, dass alle einsamen Paare im Substrat koordiniert sind und dass die Hydrolyse von PPi über einen assoziativen Mechanismus erfolgt, bei dem die elektrophile Phosphatgruppe von PPi von Nucleophilen aktivierter Wassermoleküle angegriffen wird.

Abbildung 1. Seitenvergleich der Gesamtansichten der Substrat-gebundenen Konformationen von Familie I Hefe PPase (YPPase, links) (1E6A), Familie II B. subtilis PPase (BsPPase, Mitte) (2HAW) und H⁺-pumpender Mungbohnen-PPase (VrPPase, rechts) (Kajander, T.; et al. 2013)

Familie II PPasen existieren in bakteriellen und archaealen Linien, insbesondere in Bacilli und Clostridia, einschließlich mehrerer menschlicher Krankheitserreger. Familie II PPasen sind strukturell von Familie I PPasen verschieden, und die zwei-Domänen-Proteine dieser Homodimere gehören zur "DHH" Phosphatase-Superfamilie, wobei DHH auf ein konserviertes Asp-His-His-Motiv im N-terminalen Bereich verweist, das für die Spezifität der Metallionenbindung entscheidend ist. Die aktive Stelle der Familie II PPasen befindet sich zwischen den N-terminalen DHH- und C-terminalen DHHA2-Domänen. Wie oben erwähnt, zeigen Familie II PPasen die höchste katalytische Aktivität in Anwesenheit der Metallionen Mn²⁺ oder Co²⁺. Die Bindungs- und kinetischen Präferenzen von Übergangsmetallen können gemäß der Architektur der aktiven Stelle erklärt werden.

Abbildung 2. Seitenvergleich der hydrolytischen Stellen von YPPase (links), BsPPase (Mitte) und VrPPase (rechts), wobei der Unterschied in der detaillierten Geometrie der aktiven Stelle zwischen den drei Enzymen hervorgehoben wird (Kajander, T.; et al. 2013)