LAAO

L-Aminosäureoxidase (LAAO, EC 1.4.3.2) ist eine Flavin-abhängige Oxidase, die L-Aminosäuren spezifisch oxidiert und unter Sauerstoffverbrauch eine Desaminierung zu α-Ketosäure, Ammoniak und H₂O₂ katalysiert. Sie kann für die quantitative Analyse von L-Aminosäuren, die Racematspaltung von DL-Aminosäuren sowie die Herstellung von α-Ketosäuren eingesetzt werden. In den letzten Jahren wurde in der Literatur berichtet, dass LAAO selbst antibakterielle, insektizide, antivirale und weitere biologische Aktivitäten aufweist und zudem mit Thrombozyten interagiert, zytotoxisch wirkt und Apoptose induzieren kann. Damit besitzt sie ein äußerst breites Anwendungspotenzial im biomedizinischen Bereich.

Abbildung 1. Darstellung der durch L-Aminosäureoxidasen katalysierten Reaktion. (Costa T R, et al. 2014)

Klassifizierung

LAAO kann in Abhängigkeit vom Spektrum der katalytischen Substrate in zwei Kategorien eingeteilt werden. Eine Klasse von LAAO katalysiert ein breites Substratspektrum, wie z. B. die LAAO aus Rhodococcus erythropolis, die nicht nur 20 L-Aminosäuren, sondern auch einige ihrer Derivate umsetzt. Eine weitere Klasse von LAAO katalysiert ein engeres Substratspektrum, wie z. B. die LAAO aus Rheinheimera, die ausschließlich strikt auf L-Lysin wirkt. Nach unterschiedlichen Cofaktoren kann LAAO ebenfalls in zwei Kategorien eingeteilt werden: LAAO aus Schlangengift, Bakterien und Pilzen liegen als Dimere vor und enthalten 2 FAD-Cofaktoren; LAAO aus Rattenniere weisen hingegen eine tetramere Struktur auf und enthalten 0,5 oder 1 FMN-Cofaktor.

Eigenschaften

• Substratspezifität und Substratpräferenz

Die Substratspezifität und Substratpräferenz von LAAO aus unterschiedlichen Spezies unterscheiden sich erheblich. Einige LAAOs können mehrere oder sogar Dutzende Aminosäuren katalysieren, während andere nur eine einzige Aminosäure umsetzen. Die meisten LAAOs wirken ausschließlich auf L-Aminosäuren, während andere auch D-Aminosäuren und sogar Aminosäurederivate umsetzen können. Einige Spezies enthalten sowohl LAAOs mit breiter als auch mit enger Substratspezifität. Viele LAAOs zeigen eine höhere katalytische Aktivität gegenüber hydrophoben und neutralen Aminosäuren, während einige LAAOs eine höhere Aktivität gegenüber anderen Aminosäuretypen aufweisen. Studien zeigten zudem, dass einige LAAOs unter unterschiedlichen Bedingungen unterschiedliche optimale Substrate besitzen können.

• Molekülmasse und isoelektrischer Punkt

LAAO ist aus einer Vielzahl von Quellen bekannt. Die derzeit bekannten LAAOs bestehen in der Regel aus zwei nicht-kovalent gebundenen Untereinheiten. Unter nativen Bedingungen können mittels Gelfiltration unterschiedliche Molekülmassen von LAAO bestimmt werden, typischerweise im Bereich von 93–150 kDa. Die Molekülmasse jeder Untereinheit liegt im Allgemeinen bei 36–70 kDa. Einige LAAOs bestehen aus zwei homologen Untereinheiten mit identischer Molekülmasse, während andere aus zwei nicht-homologen Untereinheiten aufgebaut sind. Der isoelektrische Punkt dieses Enzyms variiert stark und liegt zwischen 4,0 und 8,5 (sauer, neutral bis alkalisch).

• Thermische Stabilität

LAAO weist bei Lagerung bei 4°C und neutralem pH eine gute thermische Stabilität auf. Kobra-LAAO verliert bei 70°C rasch ihre Aktivität, zeigt jedoch unterhalb von 60°C eine gewisse thermische Stabilität; die Temperatur der thermischen Denaturierung liegt bei 65–70°C. Aus der östlichen Diamant-Klapperschlange isolierte LAAO zeigt reversible Aktivität, d. h. sie wird unter -20°C, bei hoher Temperatur oder unter stark alkalischen Bedingungen inaktiviert und kann bei pH=5 und 37°C wieder reaktiviert werden. Untersuchungen zur thermischen Stabilität der LAAO aus Trichoderma viride zeigten, dass sie bei 55°C 100% ihrer ursprünglichen Aktivität, bei 60°C 92%, bei 65°C 42% und bei 70°C nur 4% der ursprünglichen Aktivität erreicht.

Struktur

Derzeit liegen nur wenige Berichte zur Struktur von LAAO vor. Die LAAO des Malaiischen Python liegt als Dimer vor. Jedes Monomer hat eine Molekülmasse von 55 kDa. Es ist aus 15 α-Helices und 22 β-Faltblättern gefaltet und bildet drei Domänen: FAD-Bindungsdomäne, Substratbindungsdomäne und Helixdomäne. Zwischen der Substratbindungsdomäne und der Helixdomäne bildet sich ein trichterförmiger Substratkanal, der mit dem aktiven Zentrum verbunden ist. Das Enzym besitzt zwei Glykosylierungsstellen, eine bei Asn172 und die andere bei Asn361. Die prokaryotische LAAO aus Rhodococcus erythropolis liegt ebenfalls als Dimer vor. Jedes LAAO-Monomer besteht aus 12 α-Helices, 26 β-Faltblättern und 5 3₁₀-Helix-Faltungen und bildet drei Domänen: FAD-Bindungsdomäne, Substratbindungsdomäne und Helixdomäne.

Abbildung 2. Struktur der L-Aminosäureoxidase. (A) Das funktionelle Dimer von LAAO. (B) Ein einzelnes Protomer von LAAO.
(Pawelek P D, et al. 2000)

Im Allgemeinen wird LAAO in der Zelle zunächst als Vorläuferprotein mit einem Signalpeptid synthetisiert und anschließend durch Proteolyse zum reifen Protein prozessiert. Dies könnte mit ihrer Toxizität zusammenhängen, da Ammoniak und H₂O₂, die bei der Oxidation von Aminosäuren durch LAAO entstehen, für Zellen toxisch sind und das Zellwachstum negativ beeinflussen. Daher liegt LAAO zunächst als weniger aktiver Vorläufer in der Zelle vor und wird anschließend durch Endopeptidasen in ein hochaktives, reifes Protein gespalten, das aus der Zelle sezerniert wird.

Bestimmung der Enzymaktivität

Derzeit werden zur Bestimmung der Enzymaktivität von LAAO zwei gängige Methoden eingesetzt, nämlich die Fluoreszenzmethode und die Spektrophotometrie. Beide Methoden basieren auf der Quantifizierung der Veränderung der Menge an H₂O₂, die bei der durch LAAO katalysierten Substratreaktion gebildet wird. Die Fluoreszenzmethode beruht darauf, dass das bei der enzymatischen Reaktion gebildete H₂O₂ nicht fluoreszierende (Homo-)Vanillinsäure in eine stark fluoreszierende Substanz umwandelt; die LAAO-Aktivität wird anhand der Änderung der Fluoreszenzintensität des Reaktionssystems bestimmt. Obwohl diese Methode eine hohe Genauigkeit und Sensitivität aufweist, ist die Fluoreszenzlebensdauer kurz und es kommt leicht zu Quenching; während der Durchführung ist daher eine längere Exposition gegenüber Licht und Luft zu vermeiden. Die Spektrophotometrie beruht darauf, dass das bei der enzymatischen Reaktion gebildete H₂O₂ mit einem chromogenen Substrat reagiert und bei einer bestimmten Wellenlänge eine Absorption erzeugt; die LAAO-Aktivität wird anhand der Änderung der Absorption des Reaktionssystems gemessen. Diese Methode bietet die klaren Vorteile einer schnellen Reaktion, einfachen Handhabung, guten Reproduzierbarkeit und niedrigen Kosten. Daher ist die Spektrophotometrie die am häufigsten verwendete Methode zur Bestimmung der Enzymaktivität von LAAO.

Biologische Funktionen

• Induktion von Apoptose

Studien haben gezeigt, dass LAAO aus Schlangengift die Apoptose verschiedener Zelltypen induzieren kann; besonders häufig wird über die Induktion der Apoptose vaskulärer Endothelzellen berichtet. Untersuchungen zeigten, dass LAAO das Wachstum humaner Endothelzellen der Nabelvene hemmen und die Bildung von Zell-Tubuli dosisabhängig beeinflussen kann. Zahlreiche Experimente haben bestätigt, dass Proliferation, Migration und Tubulusbildung vaskulärer Endothelzellen Schlüsselschritte im Tumorwachstum sind. Die Hemmung der Angiogenese gilt als potenzieller Durchbruch in der Krebstherapie; daher vermuten Forschende, dass LAAO eine hemmende Wirkung auf die Tumorangiogenese besitzt. Bei der Apoptoseinduktion spielt das durch die Katalyse der Schlangengift-LAAO gebildete H₂O₂ eine zentrale Rolle. H₂O₂ reguliert die Expression des proapoptotischen Gens Fas hoch und führt zur Apoptose. Daher könnte die durch LAAO induzierte Apoptose auf das H₂O₂ zurückzuführen sein, das bei der Katalyse von L-Aminosäuren durch LAAO entsteht.

• Bakteriostatische Wirkung

Seit Langem ist bekannt, dass Klapperschlangengift eine Wirkung gegen grampositive Bakterien besitzt, und Studien haben gezeigt, dass LAAO hierbei eine antibakterielle Rolle spielt. LAAO kann an die Zelloberfläche von Escherichia coli und Bacillus subtilis binden und hohe Konzentrationen an H₂O₂ erzeugen; diese bakteriostatische Wirkung ist dosisabhängig. Je mehr LAAO dem Medium zugesetzt wird, desto stärker ist die Hemmung des bakteriellen Wachstums. Experimente zeigten, dass eine geringe Menge Peroxidase die bakteriostatische Wirkung von LAAO abschwächen kann. Die unterschiedliche Empfindlichkeit verschiedener Bakterien gegenüber LAAO könnte darauf zurückzuführen sein, dass unterschiedliche Bakterien ungleiche Mengen an Peroxidase produzieren, was zu einer unterschiedlich starken Kompensation der Oxidationswirkung führt.

• Wirkung auf Thrombozyten

Studien haben gezeigt, dass die Wirkung von Schlangengift-LAAO auf Thrombozyten zwei widersprüchliche Ergebnisse aufweist: Hemmung oder Induktion der Thrombozytenaggregation. Eine große Zahl an Publikationen weist darauf hin, dass LAAO die durch Agonisten und Scherkräfte induzierte Thrombozytenaggregation hemmt. Beispielsweise kann aus dem Schlangengift von Echis colorata isolierte und gereinigte LAAO die durch den Agonisten Adenosindiphosphat (ADP) verursachte Thrombozytenaggregation dosisabhängig unterdrücken. Es gibt jedoch auch Berichte, dass Kobra-Gift-LAAO in thrombozytenreichem Plasma eine Thrombozytenaggregation induzieren kann und dass Sarkosinphosphat sowie Sarkosinphosphokinase die durch Colobus-LAAO induzierte Thrombozytenaggregation nicht hemmen können. Diese widersprüchlichen Befunde lassen sich derzeit nicht eindeutig erklären. Sicher ist jedoch, dass H₂O₂ bei beiden gegensätzlichen Wirkungen eine wichtige Rolle spielt.

Literatur