LAAO

L-Aminosäureoxidase (LAAO, EC 1.4.3.2) ist eine Flavin-Protease, die spezifisch L-Aminosäuren oxidiert, um sie zu deaminieren und α-Ketosäuren, Ammoniak und H₂O₂ unter Sauerstoffverbrauch zu bilden. Sie kann für die quantitative Analyse von L-Aminosäuren, die Auftrennung von DL-Aminosäuren und die Herstellung von α-Ketosäuren angewendet werden. In den letzten Jahren wurde in der Literatur berichtet, dass LAAO selbst antibakterielle, insektizide, antivirale und andere biologische Aktivitäten aufweist und auch die Funktion der Interaktion mit Thrombozyten, Zytotoxizität und Induktion von Apoptose hat. Sie hat äußerst breite Anwendungsperspektiven im Bereich der Biomedizin.

Abbildung 1. Darstellung der von L-Aminosäureoxidase katalysierten Reaktion. (Costa T R, et al. 2014)

Klassifikation

LAAO kann je nach Bereich der katalytischen Substrate in zwei Kategorien unterteilt werden. Eine Klasse von LAAO katalysiert eine breite Palette von Substraten, wie Rhodococcus erythropolis LAAO, die nicht nur 20 L-Aminosäuren katalysiert, sondern auch einige ihrer Derivate. Eine andere Klasse von LAAO katalysiert eine engere Palette von Substraten, wie Rheinheimera LAAO, die nur strikt auf L-Lysin wirkt. Je nach den unterschiedlichen Cofaktoren kann LAAO auch in zwei Kategorien unterteilt werden: Schlangengift, Bakterien und Pilze LAAO sind Dimere und enthalten 2 FAD-Cofaktoren; während Rattenniere LAAO eine tetramerische Struktur hat und 0,5 oder 1 FMN-Cofaktor enthält.

Eigenschaften

• Substratspezifität und Optimalität

Die Substratspezifität und Optimalität von LAAO aus verschiedenen Arten sind ziemlich unterschiedlich. Einige LAAOs können mehrere oder sogar Dutzende von Aminosäuren katalysieren, während andere nur eine Aminosäure katalysieren können. Die meisten LAAOs können nur auf L-Aminosäuren wirken, während andere auch auf D-Aminosäuren und sogar Aminosäurederivate wirken können. Einige Arten enthalten sowohl weit verbreitet substratspezifische LAAOs als auch eng substratspezifische LAAOs. Viele LAAOs haben eine höhere katalytische Aktivität für hydrophobe und neutrale Aminosäuren, während einige LAAOs eine höhere Aktivität für andere Arten von Aminosäuren aufweisen. Die Studie hat auch gezeigt, dass einige LAAOs unter verschiedenen Bedingungen unterschiedliche optimale Substrate haben können.

• Molekulare Masse und isoelektrischer Punkt

LAAO hat eine breite Palette von Quellen. Die derzeit bekannten LAAOs bestehen im Allgemeinen aus zwei nicht-kovalent gebundenen Untereinheiten. Unter natürlichen Bedingungen kann die Gel-Filtration unterschiedliche molekulare Massen von LAAO erhalten, deren Bereich normalerweise 93-150 kDa beträgt. Die molekulare Masse jeder Untereinheit liegt im Allgemeinen zwischen 36-70 kDa. Einige LAAOs bestehen aus zwei homologen Untereinheiten mit der gleichen molekularen Masse, während andere LAAOs aus zwei nicht-homologen Untereinheiten bestehen. Der isoelektrische Punkt dieses Enzyms variiert stark und liegt zwischen 4,0-8,5 (sauer, neutral und alkalisch).

• Thermische Stabilität

LAAO hat eine gute thermische Stabilität, wenn sie bei 4 °C und neutralem pH gelagert wird. Cobra LAAO hat bei 70 °C einen schnellen Verlust der Aktivität, aber das Enzym hat eine gewisse thermische Stabilität unter 60 °C, und seine thermische Denaturierungstemperatur liegt bei 65-70 °C. LAAO, die aus der östlichen gefleckten Klapperschlange isoliert wurde, hat eine reversible Aktivität, das heißt, sie wird bei -20 °C, hohen Temperaturen oder starken Alkalibedingungen inaktiviert und kann bei pH=5, 37 °C wiederhergestellt werden. Die Studie zur thermischen Stabilität von Trichoderma viride LAAO zeigte, dass sie bei 55 °C 100 % ihrer ursprünglichen Aktivität, bei 60 °C 92 % der ursprünglichen Aktivität, bei 65 °C 42 % der ursprünglichen Aktivität und bei 70 °C nur 4 % der ursprünglichen Aktivität erreichen kann.

Struktur

Derzeit gibt es nur wenige Berichte über die Struktur von LAAO. Die LAAO der malaysischen Python ist ein Dimer. Jedes Monomer hat eine molekulare Masse von 55 kDa. Es ist durch 15 α-Helices und 22 β-Faltblätter gefaltet, um drei Domänen zu bilden: FAD-Bindungsdomäne, Substratbindungsdomäne und Helixdomäne. Ein trichterförmiger Substratkanal wird zwischen der Substratbindungsdomäne und der Helixdomäne gebildet und ist mit der aktiven Stelle verbunden. Das Enzym hat zwei Glykosylierungsstellen, eine bei Asn172 und die andere bei Asn361. Die prokaryotische Rhodococcus erythropolis LAAO ist ebenfalls ein Dimer. Jedes LAAO-Monomer besteht aus 12 α-Helices, 26 β-Faltblättern und 5 3₁₀-Helix-Faltungen, um drei Domänen zu bilden: FAD-Bindungsdomäne, Substratbindungsdomäne und Helixdomäne.

Abbildung 2. Struktur der L-Aminosäureoxidase. (A) Das funktionale Dimer von LAAO. (B) Ein einzelnes Protomer von LAAO.
(Pawelek P D, et al. 2000)

Im Allgemeinen wird LAAO zuerst in der Zelle als Vorläuferprotein mit einem Signalpeptid synthetisiert und wird dann durch Proteolyse zu einem reifen Protein. Dies könnte auf ihre Toxizität zurückzuführen sein, das heißt, Ammoniak und H₂O₂, die durch die Oxidation von Aminosäuren durch LAAO produziert werden, sind toxisch für die Zellen und haben negative Auswirkungen auf das Zellwachstum. Daher liegt LAAO zuerst als weniger aktiver Vorläufer in der Zelle vor und wird dann durch Endopeptidase in ein hochaktives reifes Protein gespalten, das außerhalb der Zelle sekretierte wird.

Enzymaktivitätsbestimmung

Derzeit gibt es zwei gängige Methoden zur Bestimmung der Enzymaktivität von LAAO, nämlich die Fluoreszenzmethode und die Spektrophotometrie. Beide Methoden basieren auf der Bestimmung der Veränderungsmenge von H₂O₂, die durch das von LAAO katalysierte Substrat produziert wird. Die Fluoreszenzmethode basiert auf dem H₂O₂, das durch die enzymatische Reaktion produziert wird, um die nicht-fluoreszierende hochvanillinsäure in eine Substanz mit starker Fluoreszenz umzuwandeln, und die LAAO-Enzymaktivität wird gemäß der Änderung des Fluoreszenzwertes des Reaktionssystems bestimmt. Obwohl die Methode eine hohe Genauigkeit und Empfindlichkeit aufweist, ist die Fluoreszenzlebensdauer kurz und sie kann leicht gelöscht werden. Es ist notwendig, während der Durchführung eine längere Exposition gegenüber Licht und Luft zu vermeiden. Die Spektrophotometrie basiert auf dem H₂O₂, das durch die enzymatische Reaktion produziert wird, das auf die pigmentierte Substanz wirkt, um eine Absorbanz bei einer bestimmten Wellenlänge zu erzeugen, und die LAAO-Enzymaktivität wird gemäß der Änderung der Absorbanz des Reaktionssystems gemessen. Diese Methode hat die offensichtlichen Vorteile einer schnellen Reaktion, einfachen Handhabung, guten Wiederholbarkeit und niedrigen Kosten. Daher ist die Spektrophotometrie die am häufigsten verwendete Methode zur Bestimmung der Enzymaktivität von LAAO.

Biologische Funktionen

• Induktion von Apoptose

Studien haben gezeigt, dass Schlangengift-LAAO die Apoptose einer Vielzahl von Zellen induzieren kann, unter denen es viele Berichte über die Induktion der Apoptose von vaskulären Endothelzellen gibt. Studien haben gezeigt, dass LAAO das Wachstum von menschlichen Nabelvenenendothelzellen hemmen und die Bildung von Zellröhren dosisabhängig beeinflussen kann. Eine große Anzahl von Experimenten hat bestätigt, dass Proliferation, Migration und Röhrenbildung von vaskulären Endothelzellen entscheidende Schritte im Tumorwachstum sind. Die Hemmung der Angiogenese wird als möglicher Durchbruchspunkt in der Krebsbehandlung angesehen, daher spekulieren die Forscher, dass LAAO die Wirkung hat, die Tumorangiogenese zu hemmen. Bei der Induktion von Apoptose spielt das H₂O₂, das durch die Katalyse von Schlangengift-LAAO produziert wird, eine Hauptrolle. H₂O₂ reguliert die Expression des pro-apoptotischen Gens Fas hoch und verursacht Apoptose. Daher könnte die durch LAAO induzierte Apoptose auf das H₂O₂ zurückzuführen sein, das durch die Katalyse von L-Aminosäuren durch LAAO produziert wird.

• Bakteriostatische Wirkung

Es ist seit langem bekannt, dass Klapperschlangengift die Wirkung hat, Gram-positive Bakterien zu bekämpfen, und Studien haben gezeigt, dass LAAO eine antibakterielle Rolle spielt. LAAO kann an die Zelloberfläche von Escherichia coli und Bacillus subtilis haften und hohe Konzentrationen von H₂O₂ produzieren, und diese bakterielle Hemmwirkung ist dosisabhängig. Je mehr LAAO dem Medium hinzugefügt wird, desto stärker ist die Hemmung des Bakterienwachstums. Experimente haben gezeigt, dass eine kleine Menge Peroxidase die Bakteriostase von LAAO hemmen kann. Die Empfindlichkeit verschiedener Bakterien gegenüber LAAO könnte darauf zurückzuführen sein, dass verschiedene Bakterien ungleiche Mengen an Peroxidase produzieren, was zu unterschiedlichen Graden der Kompensation gegenüber der Oxidation führt.

• Wirkung auf Thrombozyten

Studien haben gezeigt, dass die Rolle von Schlangengift-LAAO auf Thrombozyten zwei widersprüchliche Ergebnisse hat: Hemmung oder Induktion der Thrombozytenaggregation. Eine große Menge an Literatur zeigt, dass LAAO die durch Agonisten und Scherkräfte induzierte Thrombozytenaggregation hemmt. Zum Beispiel kann LAAO, die aus dem Schlangengift von Echis colorata isoliert und gereinigt wurde, die durch Agonisten (Adenosindiphosphat, ADP) verursachte Thrombozytenaggregation dosisabhängig hemmen. Es gibt jedoch auch Berichte, dass die Cobra-Gift-LAAO die Thrombozytenaggregation in thrombozytenreichem Plasma induzieren kann und dass Sarcosinphosphat und Sarcosinphosphokinase die durch die Colobus-LAAO induzierte Thrombozytenaggregation nicht hemmen können. Wir können diese widersprüchliche Schlussfolgerung nicht genau erklären. Aber eines ist sicher, H₂O₂ spielt eine wichtige Rolle in diesen beiden gegensätzlichen Rollen.

Literaturverzeichnis