Laktatoxidase

Lactatoxidase (Lox, EC 1.1.3.2) ist ein homotetrameres Flavoprotein, das die Oxidation von α‑Hydroxysäuren katalysiert. Der systematische Name dieses Enzyms lautet (S)-Lactat:Oxygen‑2‑Oxidoreduktase (decarboxylierend). Weitere gebräuchliche Bezeichnungen sind u. a. Lactat‑oxidative Decarboxylase, Lactatoxidase, Milchsäure‑Oxygenase, Lactat‑Oxygenase, Milchsäureoxidase, L‑Lactat‑Monooxygenase, Lactat‑Monooxygenase und L‑Lactat‑2‑Monooxygenase. Die L‑Lactatoxidase ist ein neues Mitglied der FMN‑haltigen Enzymfamilie, zu der u. a. Glykolatoxidase, L‑Lactatoxidase, L‑Lactat‑Monooxygenase, Flavocytochrom b₂, langkettige α‑Hydroxysäureoxidase sowie L‑Mandelat‑Dehydrogenase gehören.

Struktur

In der Kristallstruktur von FMN‑Enzymen liegt das Isoalloxazin‑System des Kofaktors nahezu immer in einer geknickten und damit reduzierten Konformation vor; in der Struktur von Thioredoxin hingegen findet es sich sowohl in oxidierter als auch in reduzierter Form. Der reduzierte Kofaktor wird über das Peroxo‑Addukt an C4 im Isoalloxazin‑Ringsystem regeneriert. Die Strukturen von vier verwandten Enzymen – Glykolatoxidase (GLO), einer löslichen chimären Form der Mandelatoxidase (MDH), langkettiger Hydroxysäureoxidase (HAO) und Flavocytochrom b₂ (B2) – wurden mittels Röntgenkristallographie bestimmt. In diesen Strukturen enthält jedes Monomer ein klassisches achtsträngiges α/β‑Fass (α/β‑Barrel), und die Bindungsstelle für den FMN‑Kofaktor sowie das Substrat befindet sich am C‑Terminus des β‑Fasses. In GLO und HAO besteht die biologisch aktive Einheit aus zwei Tetrameren, die leicht gegeneinander verdreht gestapelt sind. Die aktive Einheit von MDH umfasst ein Tetramer, während B2 ein Heterodimer ist, das zwei α/β‑Fässer mit FMN‑Bindungs‑ und Substratbindungsstellen enthält. B2 wurde häufig zur Aufklärung des Reaktionsmechanismus untersucht, unterscheidet sich jedoch insofern von den anderen Enzymen, als eine der Ketten zusätzlich eine an der Elektronenübertragung beteiligte Häm‑Einheit enthält; die Regeneration der Kofaktoren erfolgt daher über einen anderen Reaktionsweg.

Die asymmetrische Einheit der Lactatoxidase (LOX) enthält zwei dicht gepackte Tetramere. Jedes Tetramer bildet eine biologisch aktive Einheit und weist eine interne 422‑Symmetrie auf, ähnlich der Glykolatoxidase. Jedes LOX‑Tetramer misst ungefähr 50×100×100 Å, und sein C‑Terminus ist so gefaltet, dass er die zentrale Pore ausfüllt. Die LOX‑Monomere lassen sich gut übereinanderlegen; die quadratische Mittelwertabweichung (r.m.s.) liegt im Bereich von 0,19–0,69 Å. Am ähnlichsten sind C und F, am unterschiedlichsten C und E. Die nachfolgende Diskussion bezieht sich auf Monomer A von LOX. Das LOX‑Tetramer wurde mit dem kristallographisch erzeugten GLO‑Tetramer überlagert; dabei ergab sich eine r.m.s.-Abweichung von 1,24 Å für 1268 C^α-Atome. Die 374 Aminosäuren jeder LOX‑Untereinheit sind zu einem α/β‑Fass gefaltet, mit zwei kurzen β‑Strängen am Boden des Fasses. Ein Monomer enthält 15 α‑Helices unterschiedlicher Größe. Die FMN‑Bindungsstelle und das aktive Zentrum befinden sich am C‑Terminus des β‑Fasses; dabei bilden die LOX‑Reste 190–220 eine deckelartige Struktur über dem aktiven Zentrum. Dieser Bereich ist in Sequenzalignments nur schwach konserviert und in den Strukturen von GLO, HAO und B2 ungeordnet.

Abbildung 1. Das L‑Lactatoxidase‑Tetramer, das die Hälfte der asymmetrischen Einheit beschreibt. (Leiros I. 2006)

Abbildung 2. Die Monomerstruktur des L‑Lactatoxidase‑Tetramers. (Leiros I. 2006)

Katalytischer Mechanismus

Lactatoxidase gehört zu den FMN‑abhängigen Enzymen und katalysiert die Umwandlung von α‑Hydroxysäuren in α‑Ketosäuren über die Zwei‑Elektronen‑Reduktion des FMN‑Kofaktors. Obwohl die Details dieses Mechanismus weiterhin diskutiert werden, führt er letztlich zur Übertragung von zwei Elektronen und zwei Protonen vom reduzierten Kofaktor auf molekularen Sauerstoff, wodurch Wasserstoffperoxid und die α‑Ketosäure entstehen und der Kofaktor wieder in die oxidierte Form überführt wird. Die Reaktion verläuft nach einem Ping‑Pong‑Mechanismus mit aufeinanderfolgenden Reduktions‑ und Oxidationsschritten. Im ersten Schritt werden Protonen vom α‑Kohlenstoff des Substrats durch benachbarte Basen abstrahiert, wodurch Carbanionen entstehen; anschließend werden die zwei Elektronen auf den Kofaktor übertragen.

Anwendung

Die Lactatkonzentration wird in der klinischen Diagnostik und in der Krankheitsforschung seit langem als zentraler Parameter zur Beurteilung des Gesundheitszustands von Patientinnen und Patienten eingesetzt sowie zur kontinuierlichen Überwachung in der Chirurgie, Sportmedizin, bei Schock/Trauma und in der Lebensmittelindustrie. Zu den am häufigsten verwendeten analytischen Verfahren zur Lactatbestimmung zählen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Fluoreszenz‑, kolorimetrische und Chemilumineszenz‑Methoden sowie die Magnetresonanzspektroskopie. Obwohl diese Methoden Ergebnisse liefern, weisen sie Nachteile auf, z. B. einen zeitaufwendigen Probenvorbereitungsbedarf sowie hohe Kosten aufgrund teurer Geräte und des Erfordernisses qualifizierten Personals. Biosensoren können diese Einschränkungen jedoch überwinden. Im Vergleich zu anderen Verfahren zur Lactatdetektion bieten biosensorische Methoden die Vorteile von Einfachheit, Direktheit und Echtzeitfähigkeit – ohne Probenvorbereitung (ggf. ist eine Probenverdünnung erforderlich) – und kombinieren eine schnelle Ansprechzeit mit hoher Spezifität, Wirtschaftlichkeit und Effizienz. Das Konzept einer enzymgekoppelten Biosensor‑Elektrode besteht darin, das Enzym in unmittelbarer Nähe zur Elektrodenoberfläche zu immobilisieren. Das eingesetzte Enzym muss eine Reaktion katalysieren, die entweder den Verbrauch eines elektroaktiven Reaktanden oder die Bildung einer elektroaktiven Substanz umfasst. Anschließend wird der Verbrauchs‑ bzw. Bildungsprozess überwacht, um die Analytkonzentration direkt zu bestimmen. Bei der Herstellung von L‑Lactat‑Biosensoren werden am häufigsten L‑Lactat‑Dehydrogenase (LDH) und L‑Lactatoxidase (LOD) als biologische Erkennungselemente eingesetzt. L‑LOD katalysiert in Gegenwart von gelöstem Sauerstoff die Oxidation von L‑Lactat zu Pyruvat und bildet dabei Wasserstoffperoxid, das elektrochemisch aktiv ist und reduziert oder oxidiert werden kann, wodurch ein zur L‑Lactatkonzentration proportionales Signal entsteht; daher eignet es sich für den Einsatz in Biosensoren.

Abbildung 3. Grundprinzip des L‑Lactatoxidase‑Biosensors. (Rathee K. 2015)

Literatur