Laktatoxidase

Die Laktatoxidase (Lox, EC 1.1.3.2) ist ein homotetrameres Flavoprotein, das die Oxidation von α-Hydroxyäuren katalysiert. Der systematische Name dieses Enzyms ist (S)-Lactat: Sauerstoff 2-Oxidoreduktase (decarboxylierend). Weitere gebräuchliche Namen sind Laktat oxidative Decarboxylase, Laktatoxidase, Milchsäure-Oxygenase, Laktat-Oxygenase, Milchsäure-Oxidase, L-Laktat-Monooxygenase, Laktat-Monooxygenase, L-Laktat-2-Monooxygenase. L-Laktatoxidase ist ein neues Mitglied der FMN-haltigen Enzymfamilie, zu der auch Glykolatoxidase, L-Laktatoxidase, L-Laktat-Monooxygenase, Flavocytochrom b₂ und langkettige α-Hydroxyäure-Oxidase sowie L-Mandelat-Dehydrogenase gehören.

Struktur

In der Kristallstruktur des FMN-Enzyms existiert das Co-Faktor-Isoalloxazin-System fast immer in einer gebogenen und damit reduzierten Form, während es in der Struktur von Thioredoxin in oxidierter und reduzierter Form vorliegt. Der reduzierte Cofaktor wird durch das Peroxo-Addukt am C4 im Isoalloxazin-Ringsystem regeneriert. Die Strukturen von vier verwandten Enzymen, Glykolatoxidase (GLO), einer löslichen chimären Form der Mandelatoxidase (MDH), langkettiger Hydroxyäure-Oxidase (HAO) und Flavocytochrom b₂ (B2) wurden durch Röntgenkristallographie bestimmt. In diesen Strukturen enthält jedes Monomer ein klassisches achtsträngiges α/β-Fass, und die Bindungsstelle des FMN-Cofaktors und des Substrats befindet sich am C-Terminus des β-Fasses. In GLO und HAO besteht die biologisch aktive Einheit aus zwei Tetrameren, die leicht gedreht übereinander gestapelt sind. Die aktive Einheit in MDH enthält ein Tetramer, während es in B2 ein Heterodimer mit zwei α/β-Fässern mit FMN-Bindungs- und Substratbindungsstellen ist. B2 war immer ein Forschungsobjekt zur Aufklärung des Reaktionsmechanismus, unterscheidet sich jedoch etwas von anderen Verbindungen, da eine der Ketten auch eine Häm-Einheit enthält, die am Elektronentransfer beteiligt ist, sodass die Regeneration der Cofaktoren über einen anderen Weg erfolgt.

Die asymmetrische Einheit der Laktatoxidase (LOX) enthält zwei eng gepackte Tetramere. Jedes Tetramer bildet eine biologisch aktive Einheit und weist eine interne 422-Symmetrie auf, die der Glykolatoxidase ähnlich ist. Jedes LOX-Tetramer misst etwa 50х100х100 Å und sein C-Terminus ist gefaltet, um das zentrale Poren zu füllen. Jedes LOX-Monomer lässt sich gut mit den anderen überlagern, und die mittlere quadratische (r.m.s.) Abweichung liegt im Bereich von 0,19-0,69 Å. Die ähnlichsten sind C und F, und die unterschiedlichsten sind C und E. Die folgende Diskussion basiert auf Monomer A von LOX. Das LOX-Tetramer wurde auf das durch Kristallographie erzeugte GLO-Tetramer überlagert, mit einer r.m.s. Abweichung von 1,24 Å für 1268 C^α-Atome. Die 374 Aminosäuren in jeder LOX-Untereinheit sind in ein α/β-Fass gefaltet, mit zwei kurzen β-Strängen am Boden des Fasses. Ein Monomer enthält 15 α-Helices unterschiedlicher Größe. Die FMN-Bindungsstelle und die aktive Stelle befinden sich am C-Terminus des β-Fasses, wo die LOX-Reste 190-220 eine deckelartige Struktur der aktiven Stelle bilden. Dieser Bereich ist in der Sequenzanpassung schlecht konserviert und ist in den Strukturen von GLO, HAO und B2 ungeordnet.

Abbildung 1. Das L-Laktatoxidase-Tetramer, das die Hälfte der asymmetrischen Einheit beschreibt. (Leiros I. 2006)

Abbildung 2. Die Monomerstruktur des L-Laktatoxidase-Tetramers. (Leiros I. 2006)

Katalytischer Mechanismus

Laktatoxidase ist eines der FMN-abhängigen Enzyme, das die Umwandlung von α-Hydroxyäuren in α-Ketoäuren durch die Zwei-Elektronen-Reduktion von FMN-Cofaktoren katalysiert. Obwohl die Einzelheiten dieses Mechanismus noch diskutiert werden, führt er letztendlich zur Übertragung von zwei Elektronen und zwei Protonen vom reduzierten Cofaktor auf molekularen Sauerstoff, was Wasserstoffperoxid und α-Ketoäure erzeugt und schließlich oxidierte Cofaktoren produziert. Die Reaktion verläuft über einen Ping-Pong-Mechanismus, der aufeinanderfolgende Reduktions- und Oxidationsschritte umfasst. Der erste Schritt besteht darin, Protonen vom Substrat-α-Kohlenstoff mit benachbarten Basen zu extrahieren, um Carbanionen zu erzeugen, und dann die beiden Elektronen an den Cofaktor zu übertragen.

Anwendung

Die Laktatkonzentration wird weit verbreitet als wichtiger Parameter in der klinischen Diagnostik verwendet, um die Gesundheit von Patienten und die Krankheitsforschung zu bewerten und für die kontinuierliche Überwachung in der Chirurgie, Sportmedizin, Schock/Trauma und Lebensmittelindustrie. Die am häufigsten verwendeten analytischen Methoden zur Bestimmung von Laktat umfassen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Fluoreszenz, kolorimetrisch, Chemilumineszenz und Magnetresonanzspektroskopie. Obwohl diese Methoden Ergebnisse liefern, haben sie Nachteile, wie die zeitaufwendige Anforderung an die Probenvorbereitung, hohe Kosten aufgrund der Notwendigkeit teurer Maschinen und geschulten Personals. Biosensoren können jedoch diese Einschränkungen überwinden. Im Vergleich zu verschiedenen Methoden, die zur Laktatdetektion verwendet werden können, bieten Biosensormethoden die Vorteile von Einfachheit, Direktheit und Echtzeit, ohne Probenvorbereitung (kann eine Probenverdünnung erfordern), und kombinieren schnelle Reaktion mit hoher Spezifität, Wirtschaftlichkeit und Effizienz. Das Konzept eines enzymgekoppelten Biosensor-Elektroden besteht darin, das Enzym nahe an der Elektrodenoberfläche zu platzieren. Das beteiligte Enzym muss eine Reaktion katalysieren, die den Verbrauch eines elektroaktiven Reaktanten oder die Erzeugung einer elektroaktiven Substanz umfasst. Dann wird der Verbrauchs- oder Produktionsprozess überwacht und die Analytenkonzentration direkt gemessen. Bei der Herstellung von L-Laktat-Biosensoren sind die am häufigsten verwendeten biologischen Erkennungselemente L-Laktat-Dehydrogenase (LDH) und L-Laktat-Oxidase (LOD). L-LOD katalysiert die Oxidation von L-Laktat zu Pyruvat in Gegenwart von gelöstem Sauerstoff und bildet Wasserstoffperoxid, das elektrochemisch aktiv ist und reduziert oder oxidiert werden kann, um proportional zur L-Laktat-Konzentration zu sein, sodass es in Biosensoren verwendet werden kann.

Abbildung 3. Grundprinzip des L-Laktatoxidase-Biosensors. (Rathee K. 2015)

Literaturverzeichnis