LiP

Lignin ist eine Art komplexer und stabiler biologischer Makromoleküle, und sein Ertrag steht nur hinter Cellulose zurück. Lignin-Peroxidase (LiP) ist das Hauptenzym im Biodegradationsprozess von Lignin, das freie Radikale im Lignin-Polymer bilden, die Stabilität der Bindung verringern und das Lignin-Makromolekül zerstören kann. Lignin-Peroxidase kann Lignin in Stroh und Futter hydrolysieren, die Qualität der Futtermittel verbessern und somit ihren Nährwert erhöhen.

Eigenschaften und Quellen

1983 wurde LiP zum ersten Mal im restriktiven Medium von Phanerochaete chrysosporium gefunden. Es wird als Oxidoreduktase betrachtet und ist ein glykosyliertes extrazelluläres Protein-Peroxidase von Häm, das von dem Pilz ausgeschieden wird. Studien haben gezeigt, dass die glykosylierten Häm-Proteine von LiP normalerweise in einer Vielzahl komplexer Formen produziert werden, d.h. sie enthalten eine Vielzahl von Isoenzymen. Die Molekularmasse von LiP liegt allgemein zwischen 37 und 47 kDa. Die Molekularmasse der gereinigten LiP beträgt etwa 40 kDa, der isoelektrische Punkt liegt bei etwa 3,5, die optimale Enzymaktivitätstemperatur liegt bei 35-55°C und der optimale pH-Wert liegt bei 2-5. Das Oxidations-Reduktions-Potential von LiP beträgt 1,5 V. LiP kann aromatische Ring-Multimere in Anwesenheit von H₂O₂ oxidieren und zersetzen, was als eines der Schlüsselenzyme für den Ligninabbau betrachtet wird.

LiP wird hauptsächlich durch mikrobielle Sekretion produziert, wie z.B. Phanerochaete chrysosporium, Coriolus versicolor, Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus und Dioscorea opposita. 1989 wurde festgestellt, dass die grampositiven Bakterien T7A ebenfalls LiP produzieren können.

Struktur

LiP enthält etwa 343 Aminosäurereste und besitzt vier Disulfidbrücken. LiP faltet sich zu einer globulären Form mit einer Größe von etwa 50 × 40 × 40 Å. Es ist in proximale und distale Domänen unterteilt, wobei das Häm, das vollständig im Protein fixiert ist, durch zwei kleine Kanäle zugänglich gemacht wird. Das Faltungs-Motiv von LiP enthält acht Haupt-α-Helices, acht kleinere Helices und drei kurze antiparallele β-Faltblätter.

Katalytischer Mechanismus

LiP ist eine Reihe von Isoenzymen, die Fe³⁺, Porphyrinringe und Häm- prosthetische Gruppen enthalten. 1988 entdeckten Forscher, dass LiP eine Reihe von Substraten unter Verwendung von H₂O₂ und organischen Peroxiden katalysieren kann, und seine Katalyse ist unspezifisch. Darüber hinaus haben Studien auch gezeigt, dass LiP eine breite Palette von Substraten hat, einschließlich phenolischer und nicht-phenolischer aromatischer Verbindungen, die Substrate wie Ligninmonomere, -dimeren, -trimeren und polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (wie Benzopyren) oxidieren können. Der katalytische Zyklus der Lignin-Peroxidase umfasst drei Schritte. Der erste Reaktionsschritt ist die Oxidation des ruhenden ferrischen Enzyms [Fe (III)] durch Wasserstoffperoxid (H₂O₂) als Elektronenakzeptor, was zur Bildung des Verbindungs-I-Oxo-Ferryl-Intermediats führt. Im zweiten Schritt wird das Oxo-Ferryl-Intermediat (mangelhaft an 2e⁻) durch ein Molekül des Substrats, wie z.B. nicht-phenolisches aromatisches Substrat (S), reduziert, das ein Elektron (1e⁻) an Verbindungs-I spendet, um das zweite Intermediat, Verbindungs-II (mangelhaft an 1e⁻), zu bilden. Der letzte Schritt umfasst die anschließende Spende eines zweiten Elektrons an Verbindungs-II durch das reduzierte Substrat, wodurch LiP in den ruhenden ferrischen Oxidationszustand zurückkehrt, was den Abschluss des Oxidationszyklus anzeigt.

Abbildung 2. Katalytische Reaktion von LiP. (Falade A O. et al. 2016)

Aktivitätsbestimmung

Die Enzymaktivität von LiP wird hauptsächlich durch die Methode der Resveratrol-Oxidationsrate bestimmt. Da Resveratrol ein direktes Substrat für die Wirkung von LiP ist, wird die Enzymaktivität von LiP basierend auf dem Absorptionswert von Resveratrol gemessen, der bei 310 nm gemessen wird. Die spezifische Methode ist wie folgt: 1 mL der Reaktionslösung enthält 0,2 mL Resveratrol-Lösung, 0,4 mL Weinsäurepuffer (250 mmoL/L, pH 3,0), 0,4 mL Kultur- oder Verdünnungslösung und 20 μL einer 20 mmoL/L H₂O₂-Lösung und reagiert bei 30°C für 2 Minuten. Die Absorption bei 310 nm wurde gemessen. In der Kontrollgruppe wurde die H₂O₂-Lösung durch destilliertes Wasser ersetzt, während die anderen Reaktanten unverändert blieben.

Anwendung

In der Futtermittelindustrie kann LiP verwendet werden, um Lignin und Cellulose in Stroh abzubauen, was die Schmackhaftigkeit von Stroh verbessert und es leicht verdaulich und absorbierbar macht. In der Pestizidindustrie kann LiP, das von Phanerochaete chrysosporium produziert wird, eine Vielzahl von Polyphenolen oxidieren, und einige dieser Polyphenole sind oft Vorläufer von Breitband-Biocide oder Herbiziden. In der Papierindustrie wird das Papier mit LiP allein oder in geeigneter Kombination mit anderen Enzymen behandelt, sodass das produzierte Papier eine gute Zugfestigkeit und Glätte aufweist, was nicht nur die Weiße des Papiers verbessert, sondern auch die Kappa-Zahl des Papiers reduziert. LiP kann Industrieabwasser wie 2,4-Dibromphenol behandeln, indem es während der Oxidation Dimeren, Trimeren und Tetrameren bildet und somit die Toxizität des Abwassers beseitigt.

Referenzen