LiP

Lignin ist eine komplexe und stabile biologische makromolekulare Substanz; seine Ausbeute wird nur von der Cellulose übertroffen. Die Ligninperoxidase (LiP) ist das zentrale Enzym im Prozess der biologischen Lignin-Depolymerisation. Sie kann im Ligninpolymer freie Radikale erzeugen, die Stabilität der Bindungen herabsetzen und das Ligninmakromolekül abbauen. Ligninperoxidase kann Lignin in Stroh und Futterpflanzen hydrolysieren, die Qualität von Futtermittelkomponenten verbessern und damit deren Nährwert erhöhen.

Eigenschaften und Quellen

1983 wurde LiP erstmals in einem restriktiven Medium von Phanerochaete chrysosporium nachgewiesen. Sie gilt als Oxidoreduktase und ist eine glykosylierte, extrazelluläre Häm-Proteinperoxidase, die vom Pilz sezerniert wird. Studien zeigen, dass die glykosylierten Hämproteine der LiP üblicherweise in verschiedenen komplexen Formen vorkommen, d. h. mehrere Isoenzyme enthalten. Die Molekülmasse von LiP liegt im Allgemeinen zwischen 37 und 47 kDa. Die Molekülmasse der gereinigten LiP beträgt etwa 40 kDa, der isoelektrische Punkt liegt bei etwa 3,5, die optimale Temperatur für die Enzymaktivität bei 35–55 °C und der optimale pH-Wert bei 2–5. Das Redoxpotenzial der LiP beträgt 1,5 V. In Gegenwart von H₂O₂ kann LiP aromatische Ring-Oligomere oxidieren und abbauen und gilt daher als eines der Schlüsselenzyme des Ligninabbaus.

LiP wird hauptsächlich durch mikrobielle Sekretion gebildet, z. B. durch Phanerochaete chrysosporium, Coriolus versicolor, Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus und Dioscorea opposita. 1989 wurde festgestellt, dass auch das grampositive Bakterium T7A LiP produzieren kann.

Struktur

LiP umfasst etwa 343 Aminosäurereste und besitzt vier Disulfidbrücken. LiP faltet sich zu einer globulären Struktur mit einer Größe von etwa 50 × 40 × 40 Å. Das Häm ist vollständig im Protein fixiert, jedoch über zwei kleine Kanäle zugänglich, und trennt das Protein in proximale und distale Domänen. Das Faltungsmotiv der LiP umfasst acht große α-Helices, acht kleinere Helices sowie drei kurze antiparallele β-Faltblatt-Strukturen.

Katalytischer Mechanismus

LiP liegt als Reihe von Isoenzymen mit Fe³⁺, Porphyrinringen und Häm-Prosthetikgruppen vor. 1988 wurde gezeigt, dass LiP unter Verwendung von H₂O₂ und organischen Peroxiden eine Vielzahl von Substraten katalysieren kann und dabei eine unspezifische Katalyse aufweist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass LiP ein breites Substratspektrum besitzt, einschließlich phenolischer und nicht-phenolischer aromatischer Verbindungen, und Substrate wie Ligninmonomere, -dimere, -trimere sowie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (z. B. Benzopyren) oxidieren kann. Der katalytische Zyklus der Ligninperoxidase umfasst drei Schritte. Im ersten Reaktionsschritt wird das ruhende ferrische Enzym [Fe(III)] durch Wasserstoffperoxid (H₂O₂) als Elektronenakzeptor oxidiert, wodurch das Oxo-Ferryl-Intermediat „Compound I“ entsteht. Im zweiten Schritt wird das Oxo-Ferryl-Intermediat (um 2e⁻ elektronendefizitär) durch ein Substratmolekül, z. B. ein nicht-phenolisches aromatisches Substrat (S), reduziert, das ein Elektron (1e⁻) an Compound I abgibt und so das zweite Intermediat „Compound II“ (um 1e⁻ elektronendefizitär) bildet. Im letzten Schritt erfolgt die Abgabe eines zweiten Elektrons an Compound II durch das reduzierte Substrat, wodurch LiP in den ruhenden ferrischen Oxidationszustand zurückkehrt; damit ist der Oxidationszyklus abgeschlossen.

Abbildung 2. Katalytische Reaktion von LiP. (Falade A O. et al. 2016)

Aktivitätsbestimmung

Die Enzymaktivität von LiP wird hauptsächlich mittels der Methode zur Bestimmung der Resveratrol-Oxidationsrate ermittelt. Da Resveratrol ein direktes Substrat der LiP-Reaktion ist, wird die LiP-Aktivität anhand des bei 310 nm gemessenen Absorptionswerts von Resveratrol bestimmt. Das spezifische Vorgehen ist wie folgt: 1 mL Reaktionslösung enthält 0,2 mL Resveratrol-Lösung, 0,4 mL Weinsäurepuffer (250 mmol/L, pH 3,0), 0,4 mL Kulturüberstand oder Verdünnung sowie 20 μL einer 20 mmol/L H₂O₂-Lösung; die Reaktion erfolgt bei 30 °C für 2 min. Anschließend wird die Absorption bei 310 nm gemessen. In der Kontrollgruppe wird die H₂O₂-Lösung durch destilliertes Wasser ersetzt; die übrigen Reaktionskomponenten bleiben unverändert.

Anwendung

In der Futtermittelindustrie kann LiP zum Abbau von Lignin und Cellulose in Stroh eingesetzt werden, wodurch die Schmackhaftigkeit von Stroh verbessert wird und es leichter verdaulich sowie resorbierbar ist. In der Pestizidindustrie kann von Phanerochaete chrysosporium produzierte LiP eine Vielzahl von Polyphenolen oxidieren; einige dieser Polyphenole sind häufig Vorstufen von Breitband-Bioziden oder Herbiziden. In der Zellstoffindustrie wird Zellstoff mit LiP allein oder in geeigneter Kombination mit anderen Enzymen behandelt, sodass das hergestellte Papier eine gute Zugfestigkeit und Glätte aufweist; dies verbessert nicht nur den Weißgrad des Papiers, sondern reduziert auch die Kappa-Zahl. LiP kann industrielle Abwässer, z. B. mit 2,4-Dibromphenol, behandeln; dabei entstehen während der Oxidation Dimere, Trimere und Tetramere, wodurch die Toxizität des Abwassers eliminiert wird.

Literatur