Luciferase

Luciferase, die sich von einem Photoprotein unterscheidet, ist ein allgemeiner Begriff für eine Klasse von oxidativen Enzymen, die Biolumineszenz emittieren und in der Biotechnologie weit verbreitet für Mikroskopie und als Reportergen für viele der gleichen Anwendungen wie fluoreszierende Proteine eingesetzt werden. Allerdings unterscheidet sich die Luciferase von fluoreszierenden Proteinen, die eine externe Lichtquelle benötigen, da sie die Zugabe des verbrauchbaren Substrats Luciferin erfordert. Luciferasen aus verschiedenen Tierarten zeigen eine inhärente Variabilität in der Lichtemission, was eine kombinierte Verwendung von zwei oder mehr Luciferase-Enzymen in Multiplex-Analysen, wie Zellviabilität, in vivo Bildgebung und Einzel- und Dualspektral-Luciferase-Reporter-Assays ermöglicht.

Außerdem werden Luciferase-Reaktionen als entweder mit Blitz- oder Glühkinetik betrachtet, was spezifische Nachweisempfindlichkeiten und langlebige Emissionszeiten ermöglicht, um unterschiedlichen experimentellen Zwecken gerecht zu werden. Luciferase hat einen einzigartigen Vorteil, hohe Signal-Rausch-Verhältnisse zu erreichen, da die meisten Zellen nicht lumineszent sind, was sie zu einem besonders vielseitigen Reporterprotein macht, das in Expressionsstudien verwendet wird, um die Aktivität von Promotoren mit hoher zeitlicher Auflösung und Reproduzierbarkeit zu bestimmen, ohne das untersuchte System zu entnehmen oder zu stören. Allerdings ist die Anforderung an molekularen Sauerstoff zur Induktion von Lumineszenz eine Einschränkung von Luciferase-Reportern, die sie im Wesentlichen daran hindert, als Reporter in obligat anaeroben Bakterien eingesetzt zu werden. Die Bedeutung von Energie ATP und reduziertem Flavinmononukleotid (FMNH₂) in Reaktionen, die von Glühwürmchen- und bakteriellen Luciferasen katalysiert werden, könnte auch die Messung oder Analyse der Promotoraktivität in Stoffwechselstudien komplizieren.

Klassische Beispiele

Verschiedene Organismen steuern ihre Lichtproduktion mit unterschiedlichen Luciferasen durch eine Vielzahl von lichtemittierenden Reaktionen. Die am meisten untersuchten Luciferasen sind in Tieren vorhanden, einschließlich Glühwürmchen und Meereslebewesen wie Quallen, Copepoden und der Seepansy, während Luciferasen auch in leuchtenden Pilzen sowie in Organismen anderer Reiche wie leuchtenden Bakterien gefunden werden können. Luciferasen von Glühwürmchen und Bakterien werden häufig verwendet.

Die Luciferase von Glühwürmchen verwendet Luciferin als Substrat, um es unter Verwendung von molekularem Sauerstoff und ATP zu oxidieren und Licht bei 560 nm freizusetzen. Die Luciferasen von Glühwürmchen, die über 2000 Arten umfassen, sind so vielfältig, dass sie weit verbreitet in der molekularen Phylogenie eingesetzt werden, und der Sauerstoff, der in Glühwürmchen benötigt wird, wird durch ein Rohr im Abdomen bereitgestellt, das als abdominale Trachea bezeichnet wird. Die Luciferase von Photinus pyralis Glühwürmchen wurde gut untersucht und hat eine optimale Aktivität bei pH 7,8.

Bakterielle Luciferase, kodiert durch das luxCDABE Operon, normalerweise von Vibrio harveyi, Vibrio fischeri oder Photorhabdus luminescens, kann die Oxidation von reduziertem Flavinmononukleotid und Myristaldehyd zu Myristinsäure und Flavinmononukleotid (FMN) katalysieren und Licht mit einer Wellenlänge von 490 nm freisetzen. Bakterielle Biolumineszenz wird in Vibrio fischeri, Vibrio haweyi und Vibrio harveyi beobachtet. Einige biolumineszente Bakterien emittieren Licht, indem sie 'Antenne' nutzen, um die Energie aus dem primären angeregten Zustand der Luciferase zu akzeptieren, was zu einem angeregten Luminazin-Chromophor führt, das Licht mit einer kürzeren Wellenlänge erzeugt, während in anderen ein gelbes fluoreszierendes Protein mit FMN als Chromophor behandelt wird, das Licht mit einer Rotverschiebung im Vergleich zu dem von Luciferase emittierten Licht abgibt.

Die Auswahl des Typs von Luciferase, die verwendet werden soll, sollte berücksichtigen, dass das Enzym der Glühwürmchen eine exogene Zugabe des Decanal-Substrats erfordert, während die bakterielle Luciferase durch die Einbeziehung von luxCDE im Operon so konstruiert werden kann, dass das Substrat endogen produziert wird. Die Eignung der Luciferase zur Bestimmung der Promotoraktivität in Echtzeit hängt von der Instabilität des Enzyms ab.

Reaktionsmechanismus

Alle Luciferasen werden in die Gruppe der Oxidoreduktasen eingeteilt, was bedeutet, dass sie auf einzelne Donoren wirken, begleitet von der Einbeziehung von molekularem Sauerstoff. Da Luciferasen eine Vielfalt von nicht verwandten Arten besitzen, wurde bis jetzt kein einheitlicher Mechanismus elaboriert, während viele Mechanismen in der Kombination von Luciferase und Luciferin liegen. Darüber hinaus erfordern bis heute alle charakterisierten Luciferase-Luciferin-Reaktionen in irgendeiner Phase molekularen Sauerstoff.

Der oxidative Prozess, der von bakterieller Luciferase katalysiert wird, wurde in folgendem Verfahren verifiziert:

wobei das reduzierte Flavinmononukleotid die Oxidation eines langkettigen aliphatischen Aldehyds zu einer aliphatischen Carbonsäure durchführt. Ein angeregtes Hydroxyl-Flavin-Intermediat, das in der Reaktion gebildet wird, wird weiter dehydratisiert, um FMN zu erzeugen, das blau-grünes Licht emittiert. Fast die gesamte Energie, die in die Reaktion eingegeben wird, wird in Licht umgewandelt, mit einer Umwandlungseffizienz von 80 % bis 90 %.

Anwendungen

Genetische Ingenieurwissenschaften werden normalerweise von Labors angewendet, um Luciferasen für eine Reihe von Zwecken zu produzieren. Einige Organismen wie Mäuse, Seidenraupen und Kartoffeln werden mit Luciferase-Genen interkalariert, um das Protein zu erhalten. Die Wirkung von Luciferase auf das geeignete Luciferin-Substrat während des Oxidoreduktionsprozesses könnte Licht emittieren, das von lichtempfindlichen Apparaten wie modifizierten optischen Mikroskopen oder Luminometern wahrgenommen werden kann, was die Beobachtung biologischer Prozesse ermöglicht. Da die Biolumineszenz von Luciferase keine Lichtanregung benötigt, sind Autofluoreszenz und praktisch hintergrundfreie Fluoreszenz vernachlässigbar, und daher kann eine Probe von nur 0,02 pg immer noch präzise durch einen Standard-Szintillationszähler gemessen werden.

Luciferase wird in der biologischen Forschung häufig als Reporter verwendet, um die transkriptionale Effizienz in Zellen zu bewerten, die mit dem Luciferase-Gen unter der Kontrolle eines interessierenden Promotors transfiziert wurden. Prolumineszente Moleküle könnten in der Detektion der Enzymaktivität in gemeinsamen oder zweistufigen Luciferase-Assays angewendet werden, nachdem sie durch ein spezifisches Enzym in Luciferin umgewandelt wurden. Luciferase als wärmeempfindliches Protein könnte auch in der Untersuchung der Proteindenaturierung verwendet werden, um die schützenden Potenziale von Hitzeschockproteinen zu testen.

Bei der Bewertung der Zellviabilität oder Kinaseaktivität kann Luciferase auch verwendet werden, um den zellulären ATP-Spiegel zu bestimmen, indem sie als ATP-Sensorprotein durch Biotinylierung wirkt, das Luciferase an der Zelloberfläche immobilisiert, indem es mit einem Streptavidin-Biotin-Komplex bindet. Dies verleiht Luciferase die Fähigkeit, den ATP-Ausstrom aus der Zelle zu überwachen, was somit die Echtzeitfreisetzung von ATP durch Biolumineszenz effektiv demonstriert. Die Lumineszenzintensität als Reflexion der Empfindlichkeit für die ATP-Detektion kann durch Änderung der Sequenz bestimmter Aminosäurereste im Protein erhöht werden.

Verschiedene Zelltypen, die so konstruiert sind, dass sie eine Luciferase exprimieren, könnten nicht-invasiv innerhalb eines lebenden Tieres durch eine empfindliche CCD-Kamera visualisiert werden, die den gesamten Prozess der Tumorigenese und die Reaktion der Tumoren auf Therapien in Tiermodellen verfolgen könnte. Neben der Menge an Luciferase könnte die Signalintensität, die durch in vivo Bildgebung gemessen wird, auch mit anderen verschiedenen Faktoren verbunden sein, wie Blutfluss, intrazellulärem pH, D-Luciferin-Absorption, verfügbaren Cofaktoren, Zellmembranpermeabilität, Transparenz des darüber liegenden Gewebes usw.

Referenz