Luciferase

Luciferase, im Unterschied zu einem Photoprotein, ist ein Sammelbegriff für eine Klasse oxidativer Enzyme, die Biolumineszenz emittieren und in der Biotechnologie breit eingesetzt werden – u. a. in der Mikroskopie sowie als Reportergene für viele der gleichen Anwendungen wie fluoreszierende Proteine. Im Gegensatz zu fluoreszierenden Proteinen, die eine externe Lichtquelle benötigen, erfordert Luciferase jedoch die Zugabe des verbrauchbaren Substrats Luciferin. Luciferasen aus unterschiedlichen Tierarten weisen eine intrinsische Variabilität der Lichtemission auf, was den kombinierten Einsatz von zwei oder mehr Luciferase-Enzymen in Multiplex-Analysen ermöglicht, z. B. zur Bestimmung der Zellviabilität, für in vivo-Bildgebung sowie für Einzel- und Dualspektral-Luciferase-Reporterassays.

Darüber hinaus werden Luciferase-Reaktionen hinsichtlich ihrer Kinetik als „Flash“ oder „Glow“ klassifiziert und weisen entsprechend spezifische Nachweisempfindlichkeiten sowie unterschiedliche Emissionsdauern auf, um verschiedene experimentelle Anforderungen abzudecken. Luciferase bietet den besonderen Vorteil hoher Signal‑zu‑Rausch‑Verhältnisse, da die meisten Zellen nicht lumineszent sind. Dadurch ist sie ein besonders vielseitiges Reporterprotein, das in Expressionsstudien zur Bestimmung von Promotoraktivitäten mit hoher zeitlicher Auflösung und Reproduzierbarkeit eingesetzt wird – ohne Probenahme oder Störung des untersuchten Systems. Eine Limitation von Luciferase-Reportern ist jedoch der Bedarf an molekularem Sauerstoff zur Induktion der Lumineszenz, was ihren Einsatz als Reporter in obligat anaeroben Bakterien im Wesentlichen ausschließt. Die Beteiligung von ATP und reduziertem Flavinmononukleotid (FMNH₂) an Reaktionen, die durch Glühwürmchen- und bakterielle Luciferasen katalysiert werden, kann zudem die Messung bzw. Analyse der Promotoraktivität in metabolischen Studien erschweren.

Klassische Beispiele

Verschiedene Organismen steuern ihre Lichtproduktion über unterschiedliche Luciferasen und eine Vielzahl lichtemittierender Reaktionen. Die am besten untersuchten Luciferasen kommen in Tieren vor, einschließlich Glühwürmchen sowie marinen Organismen wie Quallen, Ruderfußkrebsen (Copepoden) und der See-Feder (Sea Pansy). Luciferasen finden sich jedoch auch in biolumineszenten Pilzen sowie in Organismen anderer Reiche, etwa in leuchtenden Bakterien. Am häufigsten werden Luciferasen aus Glühwürmchen und Bakterien genutzt.

Die Glühwürmchen-Luciferase nutzt Luciferin als Substrat und oxidiert es unter Verwendung von molekularem Sauerstoff und ATP zu Oxyluciferin; dabei wird Licht bei 560 nm emittiert. Die Luciferasen der über 2000 Glühwürmchenarten sind so vielfältig, dass sie in der molekularen Phylogenie breit eingesetzt werden. Der für die Reaktion erforderliche Sauerstoff wird bei Glühwürmchen über eine Röhre im Abdomen, die sogenannte abdominale Trachee, bereitgestellt. Die Luciferase des Glühwürmchens Photinus pyralis ist gut charakterisiert und weist ein Aktivitätsoptimum bei pH 7,8 auf.

Die bakterielle Luciferase, kodiert durch das luxCDABE-Operon (typischerweise aus Vibrio harveyi, Vibrio fischeri oder Photorhabdus luminescens), kann die Oxidation von reduziertem Flavinmononukleotid und Myristylaldehyd zu Myristinsäure bzw. Flavinmononukleotid (FMN) katalysieren und dabei Licht mit einer Wellenlänge von 490 nm emittieren. Bakterielle Biolumineszenz wird u. a. bei Vibrio fischeri, Vibrio haweyi und Vibrio harveyi beobachtet. Einige biolumineszente Bakterien emittieren Licht unter Nutzung einer „Antenne“, die Energie aus dem primären angeregten Zustand der Luciferase aufnimmt; dadurch entsteht ein angeregtes Lumazin-Chromophor, das Licht mit kürzerer Wellenlänge emittiert. In anderen Fällen fungiert ein gelbes fluoreszierendes Protein mit FMN als Chromophor, das im Vergleich zur Luciferase-Emission rotverschoben emittiert.

Bei der Auswahl des einzusetzenden Luciferase-Typs ist zu berücksichtigen, dass das Glühwürmchen-Enzym die exogene Zugabe des Decanal-Substrats erfordert, während die bakterielle Luciferase durch Einbeziehung von luxCDE in das Operon so konstruiert werden kann, dass das Substrat endogen gebildet wird. Die Eignung von Luciferase zur Echtzeitbestimmung der Promotoraktivität hängt von der Instabilität des Enzyms ab.

Reaktionsmechanismus

Alle Luciferasen werden der Gruppe der Oxidoreduktasen zugeordnet, d. h. sie wirken auf Einzeldonoren unter gleichzeitiger Einbindung von molekularem Sauerstoff. Da Luciferasen eine große Diversität nicht verwandter Spezies aufweisen, wurde bislang kein einheitlicher Mechanismus beschrieben; viele Mechanismen beruhen vielmehr auf der spezifischen Kombination aus Luciferase und Luciferin. Zudem erfordern nach heutigem Kenntnisstand alle charakterisierten Luciferase‑Luciferin‑Reaktionen in mindestens einem Schritt molekularen Sauerstoff.

Der durch bakterielle Luciferase katalysierte oxidative Prozess wurde in folgendem Ablauf verifiziert:

wobei reduziertes Flavinmononukleotid die Oxidation eines langkettigen aliphatischen Aldehyds zu einer aliphatischen Carbonsäure vermittelt. Ein in der Reaktion gebildetes angeregtes Hydroxyflavin‑Intermediat wird anschließend dehydratisiert, wodurch FMN entsteht und blaugrünes Licht emittiert wird. Nahezu die gesamte in die Reaktion eingebrachte Energie wird in Licht umgewandelt, mit einer Konversionseffizienz von 80 % bis 90 %.

Anwendungen

In Laboren wird häufig Gentechnik eingesetzt, um Luciferasen für verschiedene Zwecke zu produzieren. Einige Organismen wie Mäuse, Seidenraupen und Kartoffeln werden mit Luciferase-Genen transformiert, um das Protein zu exprimieren. Die Wirkung der Luciferase auf das geeignete Luciferin-Substrat während des Oxidoreduktionsprozesses erzeugt Licht, das mit lichtempfindlichen Geräten wie modifizierten optischen Mikroskopen oder einem Luminometer detektiert werden kann, wodurch die Beobachtung biologischer Prozesse ermöglicht wird. Da die Biolumineszenz der Luciferase keine Lichtanregung benötigt, sind Autofluoreszenz und ein praktisch hintergrundfreies Fluoreszenzsignal vernachlässigbar; daher können selbst Probenmengen von nur 0,02 pg mit einem Standard‑Szintillationszähler präzise gemessen werden.

In der biologischen Forschung dient Luciferase häufig als Reporter zur Bewertung der Transkriptionseffizienz in Zellen, die mit einem Luciferase-Gen transfiziert wurden, das unter der Kontrolle eines interessierenden Promotors steht. Prolumineszente Moleküle können zum Nachweis von Enzymaktivitäten in gekoppelten oder zweistufigen Luciferase-Assays eingesetzt werden, nachdem sie durch ein spezifisches Enzym in Luciferin umgewandelt wurden. Luciferase kann als wärmeempfindliches Protein zudem in Untersuchungen zur Proteindenaturierung verwendet werden, um das Schutzpotenzial von Hitzeschockproteinen zu prüfen.

Bei der Bewertung der Zellviabilität oder Kinaseaktivität kann Luciferase außerdem zur Bestimmung des zellulären ATP-Niveaus eingesetzt werden, indem sie als ATP‑Sensorprotein fungiert: Durch Biotinylierung wird Luciferase über einen Streptavidin‑Biotin‑Komplex an der Zelloberfläche immobilisiert. Dadurch kann Luciferase den ATP‑Efflux aus der Zelle überwachen und somit die Echtzeitfreisetzung von ATP mittels Biolumineszenz effektiv darstellen. Die Lumineszenzintensität als Maß für die Empfindlichkeit der ATP‑Detektion kann durch Veränderung der Sequenz bestimmter Aminosäurereste im Protein erhöht werden.

Unterschiedliche Zelltypen, die so konstruiert wurden, dass sie eine Luciferase exprimieren, können in einem lebenden Tier nicht-invasiv mittels einer sensitiven CCD‑Kamera (Charge‑Coupled Device) visualisiert werden. Damit lässt sich der gesamte Prozess der Tumorentstehung sowie die Reaktion von Tumoren auf Therapien in Tiermodellen nachverfolgen. Neben der Luciferase-Menge kann die mittels in vivo-Bildgebung gemessene Signalintensität auch mit weiteren Faktoren zusammenhängen, z. B. Blutfluss, intrazellulärem pH, D‑Luciferin‑Absorption, verfügbaren Kofaktoren, Zellmembranpermeabilität, Transparenz des darüberliegenden Gewebes usw.

Referenz