NALase

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Einleitung

Aldolasen katalysieren die Bildung oder Spaltung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen; entsprechende Beispiele finden sich in zahlreichen Stoffwechselwegen. Die grundlegende Aldolreaktion umfasst die Kondensation eines Aldehyds (Aldolakzeptor) mit einem Keton (Aldoldonor) zur Ausbildung einer neuen C–C-Bindung. Im Allgemeinen sind Aldolasen in ihrer Katalyse hochgradig stereoselektiv und können bei der Bildung neuer C–C-Bindungen die Konfiguration von bis zu zwei neuen chiralen Zentren steuern. Dabei sind keine aufwendigen Schutzgruppen erforderlich; zugleich wird die Stereoselektivität der Aldolkondensation kontrolliert, was die Aldolase-Familie zu einer wichtigen Enzymgruppe für die Biokatalyse macht. Derzeit wurden viele Aldolasen im Rahmen von Protein-Engineering- und Directed-Evolution-Studien untersucht und modifiziert, um ihre Eignung für die chemische Synthese zu verbessern.

N-Acetyl-d-neuraminsäure-Lyase (NALase) (EC 4.1.3.3) ist eine pyruvatabhängige Aldolase und katalysiert die reversible Aldolkondensation zwischen N-Acetyl-d-mannosamin (ManNAc) und Pyruvat zur Bildung von N-Acetyl-d-neuraminsäure (Neu5Ac). NALase gehört zur Klasse-I-Aldolase-Familie und folgt einem geordneten Bi-Uni-Mechanismus der Aldolkondensation (Schema 1), bei dem Pyruvat zunächst als Schiff-Base bindet, gefolgt von ManNAc. Die Aldoladdition erzeugt anschließend eine Schiff-Base-gebundene Neu5Ac, die danach hydrolysiert wird, wodurch Neu5Ac freigesetzt wird.  

Abbildung 1. Allgemeiner Reaktionsmechanismus der NALase (Daniels, A.D. et al.2014)

Nach jahrelanger intensiver Arbeit haben kristallographische Studien die dreidimensionale Struktur der NALase einschließlich gebundener Substrate und Substratanaloga aufgeklärt; sie haben jedoch nicht den Übergangsprozess zwischen diesen energiearmen, stabilen Zuständen offengelegt. Strukturdaten zu hochenergetischen Übergangszuständen sind mittels Kristallographie nahezu nicht zugänglich; diese Informationen können jedoch durch computergestützte Modellierung gewonnen werden, wobei insbesondere Quantenmechanik/Molekularmechanik-(QM/MM)-Methoden bei der Modellierung enzymatischer Reaktionen eine herausragende Rolle spielen.

QM/MM-Modellierung

Nach der in silico-Rückmutation von Ala137 zu Tyr wurde die Struktur mit gebundenem Pyruvat und ManNAc in Untereinheit C als Ausgangspunkt für die QM/MM-Modellierung des Reaktionsmechanismus verwendet. Zu Beginn führten die Forschenden QM/MM-Umbrella-Sampling-Molekulardynamik-(MD)-Simulationen entlang d(CC) durch. ManNAc, die Pyruvat-Schiff-Base sowie die Seitenkette von Tyr137 wurden in die QM-Region einbezogen; es wurden fünf Reihen von Umbrella-Sampling-Simulationen durchgeführt. In allen Fällen wird das Hydroxylproton von Tyr137 spontan auf den Aldehydsauerstoff von ManNAc übertragen, und in der finalen Struktur entsteht eine Neu5Ac-Lys165-Schiff-Base.

Aus den mittels Umbrella Sampling erhaltenen Freien-Energie-Profilen ergibt sich, dass die Energie des Intermediats etwa 4–8 kcal mol^-1 niedriger liegt als die des Übergangszustands. Die Spontaneität dieser Reaktion und die deutlich niedrigere freie Energie der Intermediate deuten darauf hin, dass Tyr137 im Wildtyp-NALase-Reaktionsablauf als Protonendonor fungiert, was mit früheren Annahmen übereinstimmt.

In den Simulationen entfernt sich das Wassermolekül häufig von dieser Position, und der Protonentransfer von Tyr137 auf den Aldehydsauerstoff von ManNAc erfolgt wie zuvor. Wassermoleküle sollten daher nicht direkt an der Reaktion beteiligt sein. Der Prozess der Schiff-Base-Spaltung zwischen Lys165 und Substrat/Produkt erfordert jedoch Wasser, das zudem zur Reprotonierung des Tyr137-Phenats genutzt werden kann. Die Analyse der MD-Trajektorien zeigt, dass der Angriff auf die Pyruvat-Kohlenstoffatome nahezu immer von der si-Seite erfolgt und diese Präferenz ausgeprägter wird, je näher die Kohlenstoffatome einander kommen. Die Simulationen sprechen daher stark dafür, dass der ManNAc-Bindungsmodus im Wildtyp der NALase der wesentliche Beitrag zur berichteten hohen Stereoselektivität ist.

Abbildung 2. QM/MM-Potenzialenergieprofile für die C–C-Bindungsbildung zwischen ManNAc und der Pyruvat-Lys165-Schiff-Base, mit Tyr137 als Protonendonor (Daniels, A.D. et al.2014)

Enzymmechanismus und Mutagenese

Auf Basis der oben dargestellten Kristallstruktur- und QM/MM-Simulationsdaten kann der detaillierte Mechanismus der C–C-Bindungsbildung zwischen ManNAc und Pyruvat vorgeschlagen werden.

Abbildung 3. Mechanismus der C–C-Bindungsbildung und Protonierung während der NALase-Katalyse, abgeleitet aus der Kristallstruktur der Y137A-Variante in Anwesenheit von Pyruvat und ManNAc sowie aus QM/MM-Modellierung (Daniels, A.D. et al.2014)

Die Enaminform des Pyruvats liegt als Schiff-Base-Komplex mit Lys165 vor und greift die si-Seite des ManNAc-Aldehyds an, wodurch Neu5Ac gebildet wird. Die erhöhte Elektronendichte am (ehemaligen) Aldehydsauerstoff von ManNAc (bedingt durch die tetraedrische Konformation am Aldehydkohlenstoff) wird durch Wasserstoffbrückenbindungen der Hydroxylgruppen von Thr167 und Tyr137 stabilisiert. Nach Ausbildung der C–C-Bindung wird der (ehemalige) Aldehydsauerstoff von ManNAc durch die Hydroxylgruppe von Tyr137 protoniert. QM/MM-Energien zeigen, dass dieses Neu5Ac-Schiff-Base-Intermediat mit einem Tyr137-Phenat sehr stabil ist.

Zwei Varianten an Tyr137 (Y137A und Y137F) wirken sich nachteilig auf die Aktivität aus. Es ist inzwischen bestätigt, dass dies darauf zurückzuführen ist, dass Tyr137 eine entscheidende Rolle bei der Bildung der C–C-Bindung zwischen ManNAc und Pyruvat spielt. Die Mutageneseergebnisse bestätigten zudem die Bedeutung von Thr167 für die Stabilisierung des Übergangszustands durch Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zum (ehemaligen) Aldehydsauerstoff. Im Fall von Tyr110' führte der Austausch gegen Alanin an der am weitesten vom aktiven Zentrum entfernten Position der Triade zu einer deutlichen Abnahme von kcat/Km (40-fach), während der Austausch gegen das voluminösere Phenylalanin keine signifikante Änderung der Kinetik verursachte.