NALase

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Einführung

Aldolase katalysiert die Bildung oder Spaltung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, und Beispiele sind in vielen Stoffwechselwegen zu finden. Die grundlegende Aldolreaktion umfasst die Kondensation eines Aldehyds (der Aldol-Akzeptor) mit einem Keton (der Aldol-Spender), um eine neue Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung zu bilden. Allgemein gesprochen sind Aldolasen in ihrer Katalyse hoch stereoselektiv und können die Konfiguration von bis zu zwei neuen chiralen Zentren steuern, während sie neue Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen bilden. In diesem Prozess ist keine aufwendige Schutzgruppen erforderlich, und gleichzeitig wird die Stereoselektivität der Aldolkondensation kontrolliert, was die Aldolase-Familie zu einer wichtigen Gruppe von Enzymen für die Biokatalyse macht. Derzeit wurden viele Aldolasen in der Proteinengineering- und gerichteten Evolutionsforschung untersucht und modifiziert, um ihre Nützlichkeit in der chemischen Synthese zu verbessern.

N-Acetyl-d-neuraminsäure-Lyase (NALase) (EC 4.1.3.3) ist eine pyruvatabhängige Aldolase, die für die Katalyse der reversiblen Aldolkondensation zwischen N-Acetyl-d-mannosamin (ManNAc) und Pyruvat verantwortlich ist, um N-Acetyl-d-neuraminsäure (Neu5Ac) zu produzieren. NALase ist ein Mitglied der Klasse I Aldolase-Familie, die einem geordneten Bi-Uni-Aldolkondensationskinetikmechanismus (Schema 1) folgt, bei dem Pyruvat zuerst als Schiff-Basen bindet, gefolgt von ManNAc. Die Aldoladdition produziert dann die Schiff-Basen-gebundene Neu5Ac, die dann hydrolysiert wird, um Neu5Ac freizusetzen.  

Abbildung 1. Allgemeiner Reaktionsmechanismus von NALase (Daniels, A.D. et al.2014)

Nach jahrelanger harter Arbeit haben kristallographische Studien die dreidimensionale NALase-Struktur bestimmt, die gebundene Substrate und Substratanaloga umfasst, aber sie haben den Übergangsprozess zwischen diesen energiearmen, stabilen Zuständen nicht offenbart. Es ist fast unmöglich, strukturelle Daten von hochenergetischen Übergangszuständen durch Kristallographie zu erhalten, aber diese Informationen können durch computergestütztes Modellieren, insbesondere die Methoden der Quantenmechanik/Molekulardynamik (QM/MM), die sich bei der Modellierung von Enzymreaktionen als sehr herausragend erweisen, gewonnen werden.

QM/MM-Modellierung

Nach in silico Mutationen von Ala137 zurück zu Tyr wurde die Struktur, die Pyruvat und ManNAc in Untereinheit C bindet, als Ausgangspunkt für die QM/MM-Modellierung des Reaktionsmechanismus verwendet. Zunächst führten die Forscher QM/MM-Umbrella-Sampling-Molekulardynamik (MD)-Simulationen entlang von d(CC) durch. ManNAc, Pyruvat-Schiff-Basen und die Seitenketten von Tyr137 wurden in den QM-Bereich einbezogen, fünf Serien von Umbrella-Sampling-Simulationen wurden durchgeführt. In allen Fällen wird das Hydroxylproton von Tyr137 spontan auf den Aldehydsauerstoff von ManNAc übertragen, und die Schiff-Basen-gebundene Neu5Ac-Lys165 wird in der Endstruktur produziert.

Aus den freien Energieprofilen, die aus dem Umbrella-Sampling gewonnen wurden, liegt die Energie des Intermediats etwa 4-8 kcal mol^-1 unter dem Übergangszustand. Die Spontaneität dieser Reaktion und die signifikant niedrigeren freien Energieintermediate deuten darauf hin, dass Tyr137 der Protonenspender in der Wildtyp-NALase Reaktion ist, was mit früheren Spekulationen übereinstimmt.

In den Simulationen bewegt sich das Wassermolekül oft von dieser Position weg, und der Protonentransfer von Tyr137 zu ManNAc-Aldehydsauerstoff erfolgt wie zuvor. Daher sollten Wassermoleküle nicht direkt an der Reaktion teilnehmen. Der Zerfallsprozess der Schiff-Basen zwischen Lys165 und dem Substrat/Produkt erfordert jedoch Wasser, das auch verwendet werden kann, um Tyr137-Phenolat wieder zu protonieren. Die Analyse der MD-Trajektorien zeigt, dass der Angriff auf die Pyruvat-Kohlenstoffe fast immer von der si Seite erfolgt, und diese Präferenz wird ausgeprägter, je näher die Kohlenstoffatome beieinander liegen. Daher deutet die Simulation stark darauf hin, dass der Bindungsmodus von ManNAc in der Wildtyp-NALase der Hauptbeitrag zur berichteten hohen Stereoselektivität ist.

Abbildung 2. QM/MM-Potentialenergieprofile für die Bildung der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung zwischen ManNAc und der Pyruvat-Lys165-Schiff-Basis, mit Tyr137 als Protonenspender (Daniels, A.D. et al.2014)

Enzymmechanismus und Mutagenese

Basierend auf der Kristallstruktur und den oben eingeführten QM/MM-Simulationsdaten kann der detaillierte Mechanismus der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungsbildung zwischen ManNAc und Pyruvat vorgeschlagen werden.

Abbildung 3. Mechanismus der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungsbildung und Protonierung während der NALase-Katalyse, abgeleitet aus der Kristallstruktur der Y137A-Variante in Anwesenheit von Pyruvat und ManNAc sowie QM/MM-Modellierung (Daniels, A.D. et al.2014)

Die Enaminform von Pyruvat, im Schiff-Basen-Komplex mit Lys165, greift die si Seite des ManNAc-Aldehyds an, um Neu5Ac zu bilden. Die erhöhte Elektronendichte um den (ehemaligen) ManNAc-Aldehydsauerstoff (aufgrund der tetraedrischen Konformation, die um das Aldehyd-Kohlenstoffatom erscheint) wird durch Wasserstoffbrücken von den Hydroxylgruppen von Thr167 und Tyr137 stabilisiert. Sobald die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung gebildet ist, wird der (ehemalige) ManNAc-Aldehydsauerstoff von der Hydroxylgruppe von Tyr137 protoniert. QM/MM-Energien zeigen, dass dieses Neu5Ac-Schiff-Basen-Intermediate mit einem Tyr137-Phenolat sehr stabil ist.

Zwei Varianten bei Tyr137 (Y137A und Y137F) haben eine schädliche Wirkung auf die Aktivität. Es wurde nun bestätigt, dass dies daran liegt, dass Tyr137 eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zwischen ManNAc und Pyruvat spielt. Die Mutagenesergebnisse bestätigten auch die Bedeutung von Thr167 zur Stabilisierung des Übergangszustands durch Bildung von Wasserstoffbrücken zum (ehemaligen) Aldehydsauerstoff. Im Fall von Tyr110' führte der Austausch von Alanin an der am weitesten vom aktiven Zentrum entfernten Triade zu einem signifikanten Rückgang von kcat/Km (40-fach), während der Austausch mit dem voluminöseren Phenylalanin keine signifikante Änderung der Kinetik verursachte.