Neutrale Protease

Unter Neutralproteasen versteht man eine Klasse von Proteasen, die unter neutralen, schwach sauren oder schwach alkalischen Bedingungen katalytisch wirksam sind. Ihr pH-Optimum liegt zwischen 6,0 und 7,5; sie katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen in Proteinen und setzen dabei Aminosäuren oder Peptide frei. Neutralproteasen zeichnen sich durch eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit, das Ausbleiben industrieller Umweltbelastungen sowie eine breite Toleranz gegenüber unterschiedlichen Reaktionsbedingungen aus.

Klassifizierung

Neutralproteasen lassen sich in Abhängigkeit vom katalytischen Mechanismus und der funktionellen Gruppe im aktiven Zentrum in vier Hauptkategorien einteilen: Serinproteasen, Aspartatproteasen, Cysteinproteasen und Metalloproteasen.

Serinprotease: Serinproteasen katalysieren die Hydrolyse von Substratproteinen typischerweise in zwei Schritten. Während des Hydrolyseprozesses entsteht ein kovalenter Enzym‑Peptid‑Komplex als Zwischenprodukt, gefolgt von der Abspaltung von Aminosäuren und der Spaltung der Peptidkette. Anschließend wird die Acylgruppe entfernt; die Peptidbindung wird durch nukleophilen Angriff von Wasser auf das Zwischenprodukt hydrolysiert. Die meisten Serinproteasen besitzen die charakteristische katalytische Triade Ser‑His‑Asp, wobei eine geringe Menge Serin als katalytische Grundlage dient.

Aspartatprotease: Das aktive Zentrum der Aspartatprotease ist von Aspartat‑Resten abhängig. Die Aspartat‑Reste im aktiven Zentrum der meisten Pepsin‑Familienmitglieder liegen im Asp‑Thr‑Gly‑Xaa‑Motiv, das an den zweilappigen Amino‑ und Carboxylenden lokalisiert ist. Xaa kann durch Ser oder Thr ersetzt werden; die Seitenkette ist über Wasserstoffbrückenbindungen mit Asp verknüpft.

Cysteinprotease: Die katalytischen Mechanismen von Cysteinproteasen ähneln denen der Serinproteasen. Untersuchungen der katalytischen Mechanismen mehrerer Cysteinproteasen aus unterschiedlichen evolutionären Quellen zeigen ausgeprägte Gemeinsamkeiten. Papain gilt als Prototyp für den katalytischen Mechanismus von Cysteinproteasen. Unterschiede ergeben sich hauptsächlich aus den unterschiedlichen Konformationen der aktiven Zentren: Serinproteasen enthalten eine Ser‑His‑Asp‑Triade, während bei der Hydrolyse durch Cysteinproteasen eine Säuregruppe beteiligt ist und ein Acyl‑Mercaptan‑Zwischenprodukt gebildet wird.

Metalloproteinase: Metalloproteasen weisen im Vergleich zu den oben genannten Proteasen einen abweichenden katalytischen Mechanismus auf. Diese Enzymklasse ist auf das Vorhandensein zweiwertiger Metallkationen angewiesen und kann durch Dialyse oder Metallchelatoren inaktiviert werden. Röntgenkristallographische Untersuchungen haben gezeigt, dass die meisten Metalloproteasen während der Kristallbildung in der Enzymstruktur eine Metallbindungsstelle ausbilden. Das Metallkation ist üblicherweise Zn²⁺, kann jedoch auch andere Metallkationen wie Mg²⁺ oder Cu²⁺ sein. Das Metallion im aktiven Zentrum kann durch Chelatbildner wie EDTA oder OP komplexiert werden, wodurch das Enzym seine partielle oder vollständige Aktivität verliert. Dieser Prozess ist in der Regel reversibel; die Enzymaktivität kann durch erneute Zugabe von Metallionen wiederhergestellt werden.

Quellen

Aufgrund ihrer besonderen Rolle im Stoffwechsel kommen Neutralproteasen in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen weit verbreitet vor. Im Vergleich zu anderen Quellen bieten mikrobielle Proteasen aufgrund der Kultivierungsbedingungen, der Steuerbarkeit der Produktionskosten und der Skalierbarkeit der Herstellung deutliche Vorteile. Nach ihrer Herkunft lassen sich Neutralproteasen in bakterielle, fungale und virale Neutralproteasen einteilen.

Bakterielle Neutralprotease: Die am häufigsten am Markt eingesetzten Neutralproteasen sind bakterielle Neutralproteasen, insbesondere solche aus Bacillus, z. B. Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis. Die Enzymaktivität bakterieller Neutralproteasen ist überwiegend von zweiwertigen Kationen wie Mg²⁺, Zn²⁺ und Ca²⁺ abhängig. Bakterielle Proteasen besitzen eine starke Hydrolyseleistung und eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit; die Hydrolysate weisen eine geringere Bitterkeit auf, weshalb sie in der Lebensmittelindustrie breit eingesetzt werden.

Fungale Neutralprotease: Viele Pilze können Neutralproteasen produzieren, z. B. Aspergillus oryzae, Rhizopus und Mucor. Zudem ist der katalytische pH‑Bereich fungaler Proteasen breit (in der Regel 4 bis 11). Aspergillus oryzae kann saure, neutrale und alkalische Proteasen bilden. Die Herstellung fungaler Proteasen erfolgt überwiegend mittels Feststofffermentation. Ihre Proteaseaktivität ist hauptsächlich von zweiwertigen Kationen abhängig und kann durch Metallchelatoren beeinflusst werden. Im Allgemeinen sind Reaktionsgeschwindigkeit und Stabilität fungaler Proteasen im Vergleich zu bakteriellen Proteasen geringer.

Virale Neutralprotease: Die Forschung zu viralen Proteasen konzentriert sich weitgehend auf den medizinischen Bereich. Zu den viralen Proteasen zählen Aspartatproteasen, Serinproteasen und Cysteinproteasen. Alle virusabgeleiteten Proteasen sind Endonukleasen, und ihre Aktivität erfordert keine Beteiligung von Metallionen. Aufgrund ihrer besonderen Bedeutung in der Medizin werden zunehmend Untersuchungen zur dreidimensionalen Struktur, Translation, zum Expressionsmechanismus und zum Wirkmechanismus viraler Proteasen durchgeführt.

Anwendungen

Anwendungen in der Lebensmittelindustrie: Neutralproteasen werden in der Lebensmittelindustrie breit eingesetzt, um Qualität, Stabilität und Löslichkeit von Lebensmitteln zu verbessern. Von Aspergillus oryzae produzierte Neutralproteasen können durch Hydrolyse die Eigenschaften von Gluten in Mehl verändern; bakterienbasierte Neutralproteasen können zur Erhöhung der Dehnbarkeit und Zähigkeit von Teig eingesetzt werden. Neutralproteasen finden auch Anwendung bei der Getränkeklärung. Da der Auszug von Schwarztee aufgrund seines hohen Gehalts an löslichen Proteinen mit Neutralprotease verdaut wird, verändert sich der Ultrafiltrationsfluss signifikant. Neutralproteasen können zudem zur Fleischzartmachung eingesetzt werden, vor allem weil sie Myofibrillen und Elastin lösen können. Neutralproteasen spielen auch bei der Verarbeitung von Sojaprodukten eine wichtige Rolle. Am Beispiel von Bohnenpaste führt die während der Fermentation vom Pilz gebildete Neutralprotease zu einer weitgehenden Hydrolyse der Proteine im Sojamaterial. Neben der Bereitstellung notwendiger Wachstumsfaktoren für Mikroorganismen fördert dies die Bildung zahlreicher vorteilhafter Aminosäuren und erhöht damit effektiv den Nährwert der Produkte.

Anwendungen in der Lederindustrie: Proteasen werden hauptsächlich eingesetzt, um nicht‑pektinische Komponenten in Leder selektiv zu hydrolysieren und nicht‑fibrilläre Bestandteile wie Albumin und Globulin zu entfernen. Der Einsatz von Proteasen in der Lederindustrie kann die Einweichzeit verkürzen. Die Auswahl der Neutralprotease‑Zubereitung hängt von der Spezifität des Matrixproteins ab; die Enzymmenge richtet sich nach der Weichheit bzw. Härte des zu behandelnden Leders. Die Anwendung von Neutralproteasen in der Lederverarbeitung trägt nicht nur zur Reduktion der Umweltbelastung bei, sondern spart auch Energie.

Anwendungen in der Kosmetik: Neutralproteasen werden in der Herstellung und Entwicklung von Kosmetika breit eingesetzt. In Kosmetika verwendete Neutralproteasen stammen überwiegend aus Mikroorganismen und Pflanzen. Die Zugabe von Neutralprotease zu Zahnpasta unterstützt die Entfernung von Zahnstein, insbesondere Neutralprotease aus Bacillus subtilis. Neutralproteasen werden Cremes zugesetzt, um Schuppen zu lösen, die Haut zu glätten, den Hautstoffwechsel zu fördern, die dermale Aufnahme von Wirkstoffen zu erhöhen und die Resistenz pathogener Bakterien in der Hornschicht zu reduzieren. Gleichzeitig sind mikrobiell gewonnene Neutralproteasen hitzebeständiger, können gealterte Keratinozyten entfernen, die Reinigungswirkung verstärken und der Aknebildung vorbeugen.

Anwendungen in der pharmazeutischen Industrie: In der pharmazeutischen Industrie werden Proteasen zur Herstellung von Arzneimitteln eingesetzt, z. B. Wunddébridement‑Salben, Salben zur Erweichung von Brandnarben sowie Arzneimittel mit entzündungshemmender, abschwellender und schleimlösender Wirkung. Neutralproteasen weisen eine hohe Diversität und Substratspezifität auf, was einen klaren Vorteil bei der Entwicklung hochwirksamer Therapeutika darstellt.