Nhase

In der Enzymologie können Nitril-Hydratasen (NHasen; EC 4.2.1.84), die an der mikrobiellen Nitrilassimilation beteiligt sind, grob in zwei Gruppen eingeteilt werden, je nach dem beteiligten Metall: mononukleare Eisen- und nicht-corrinoide Kobalt-Enzyme, die die Hydratation verschiedener Nitrile zu ihren entsprechenden Amiden katalysieren, die dann durch eine Amidase in Carbonsäure umgewandelt werden. NHase hat großes Potenzial als Katalysator in der organischen chemischen Verarbeitung, da sie Nitrile unter milden Bedingungen in die entsprechenden höherwertigen Amide umwandeln kann und seitdem zu einem der wichtigsten industriellen Enzyme geworden ist, da sie in der Lage ist, außergewöhnlich hohe Konzentrationen von Amiden in bemerkenswert schneller Weise anzusammeln. NHase und Amidase als zwei hydrierende und hydrolytische Enzyme sind verantwortlich für den sequenziellen Stoffwechsel von Nitrilen in Bakterien, die in der Lage sind, Nitrile als ihre einzige Quelle für Stickstoff und Kohlenstoff zu nutzen, und sie könnten gemeinsam als Alternative zur Nitrilase fungieren, die die Hydrolyse von Nitrilen ohne Bildung eines intermediären primären Amids verursacht.

Quellen

Eine große Anzahl von NHasen wurde in einer Reihe von Mikroorganismen nachgewiesen. Die Gesamtheit der bekannten mesophilen NHase-produzierenden Mikroorganismen wird von der Gattung Rhodococcus dominiert, und bisher wurden nur fünf thermophile NHase-produzierende Organismen berichtet. Verschiedene NHase-Untergruppen zeigen signifikante Unterschiede in Herkunft, Stabilität, Cofaktoranforderungen und katalytischen Eigenschaften, während es in Bezug auf Größe und Proteinsequenz zwischen diesen Enzymen eine hohe Ähnlichkeit gibt. Eine Sequenz im Genom des Choanoflagellaten Monosiga brevicollis könnte für eine NHase kodieren, und das Gen von Monosiga brevicollis bestand aus sowohl α- als auch β-Untereinheiten, die zu einem einzigen Gen fusioniert sind. Ähnliche NHase-Gene, die aus einer Fusion der α- und β-Untereinheiten bestehen, wurden auch in mehreren eukaryotischen Supergruppen identifiziert, was darauf hindeutet, dass solche NHasen im letzten gemeinsamen Vorfahren aller Eukaryoten vorhanden sind.

Molekulare Struktur

NHasen bestehen aus α- und β-Untereinheiten, die in der Aminosäuresequenz nicht verwandt sind, existieren in Form von αβ-Dimeren oder α₂β₂-Tetrameren und binden ein Metallatom pro αβ-Einheit. Die Bestimmung der 3D-Strukturen zahlreicher NHasen zeigt, dass die α-Untereinheit aus einem langen, erweiterten N-terminalen Arm besteht, der zwei α-Helices umfasst, und einer C-terminalen Domäne mit einer ungewöhnlichen vierlagigen Struktur. Die β-Untereinheit umfasst eine lange N-terminale Schleife, die sich um die α-Untereinheit wickelt, eine helikale Domäne, die mit der N-terminalen Domäne der α-Untereinheit verpackt ist, und eine C-terminale Domäne mit einer β-Rolle und einer kurzen Helix. Es wurde festgestellt, dass NHase sowohl in αβ- als auch in α₂β₂-Formen existiert, und in vitro-Massenspektrometrie-Experimente zeigen weiter, dass α- und β-Untereinheiten zunächst zu einem αβ-Dimer assemblieren können, das anschließend interagieren kann, um ein Tetramer zu bilden.

Metall-Cofaktor

In der Biochemie existiert Kobalt allgemein in einem Corrinring, und NHase ist eines der seltenen Enzymtypen, die Kobalt auf nicht-corrinoide Weise nutzen. Obwohl ein Kobalt-Permease, das Kobalt über die Zellmembran transportiert, identifiziert wurde, ist der Mechanismus, durch den das Kobalt zu NHase transportiert wird, ohne Toxizität auszulösen, noch unklar. Das Vorhandensein der Aminosäuresequenz VCTLC weist auf eine Co-zentrierte NHase hin, und die Existenz von VCSLC manifestiert eine Fe-zentrierte NHase. Die Identität des Metalls im aktiven Zentrum einer NHase kann durch die Analyse der Sequenzdaten der α-Untereinheit in dem Bereich, in dem das Metall angebracht ist, vorhergesagt werden.

Mechanismus

Das Metallzentrum befindet sich in der zentralen Höhle an der Schnittstelle zwischen zwei Untereinheiten, und alle Proteinliganden zum Metallatom werden von der α-Untereinheit bereitgestellt. Zwei Carboxamidstickstoffe, ein Cystein-Schwefel und zwei Schwefel aus der Cystein-Sulfenic (Cys-SO) und Cystein-Sulfinic (Cys-SO₂) Säuregruppe bilden jeweils das Donoreinstellungsumfeld um das Metallzentrum der NHase. Das Metallion ist oktahedral koordiniert, wobei die Proteinliganden an den fünf Ecken des Oktaeders angeordnet sind. Die sechste Position wird entweder von NO oder einem lösungsmittel-austauschbaren Liganden (Hydroxid oder Wasser) eingenommen. Die Bindung von NO an der sechsten Stelle des Eisen(III)-Zentrums könnte die Aktivität des Enzyms modulieren, während auch vorgeschlagen wird, dass ein metallgebundenes Hydroxid zur Hydratation von Nitrilen beitragen könnte. Die beiden Cys-Reste, die an das Metall koordiniert sind, werden translational in Cys-sulfinic (Cys-SO₂) und Cys-sulfenic (Cys-SO) Säuren modifiziert. Quantenchemische Studien haben vorhergesagt, dass der Cys-SO-Rest entweder als Base zur Aktivierung eines nucleophilen Wassermoleküls oder als Nucleophil fungieren könnte. Strukturelle und spektroskopische Studien zu Eisen(III)- und Kobalt(III)-Komplexen haben gezeigt, dass die ungewöhnliche Koordinationsstruktur des Metall(III)-Standorts sein Potenzial erhöhen, jede Redoxaktivität ausschalten, die Bindung von NO an der sechsten Stelle und die oxidative Modifikation der gebundenen S-Donoren ermöglichen und auch den pKa des metallgebundenen Wassers nahe 7 bringen könnte.

Industrielle Anwendungen

NHase wird seit langem effizient in der industriellen Produktion von Acrylamid aus Acrylonitril in einem Umfang von 600.000 Tonnen pro Jahr eingesetzt, was das erste erfolgreiche Beispiel eines Biotransformationsprozesses zur Herstellung eines chemischen Rohstoffs ist. NHasen wurden auch zur Entfernung von Nitrilen aus Abwasser eingesetzt. NHasen, die Stickstoffmonoxid (NO) an das Eisen-Zentrum gebunden haben, sind intrinsisch lichtempfindlich und können durch Photodissoziation aktiviert werden. Nikotinamid wird industriell durch Hydrolyse von 3-Cyanopyridin unter der Katalyse der Nitril-Hydratase von Rhodococcus rhodochrous J1 produziert, wobei gleichzeitig 3500 Tonnen pro Jahr Nikotinamid für die Anwendung in Tierfutter erzeugt werden.

Referenz