Nhase

In der Enzymologie lassen sich Nitrilhydratase(n) (NHasen; EC 4.2.1.84), die an der mikrobiellen Nitrilassimilation beteiligt sind, grob in zwei Gruppen einteilen – abhängig vom beteiligten Metall: mononukleare Eisen- sowie nicht-corrinoide Cobalt-Enzyme. Diese katalysieren die Hydratisierung unterschiedlichster Nitrile zu den entsprechenden Amiden, die anschließend durch eine Amidase zu Carbonsäuren umgesetzt werden. NHasen gelten als vielversprechende Biokatalysatoren für organisch-chemische Prozessierungen, da sie Nitrile unter milden Bedingungen in die entsprechenden, höherwertigen Amide überführen können, und zählen zu den wichtigsten Industrieenzymen, weil sie außergewöhnlich hohe Amidkonzentrationen in bemerkenswert kurzer Zeit akkumulieren können. NHase und Amidase sind als hydratisierende bzw. hydrolytische Enzyme für den sequenziellen Nitrilstoffwechsel in Bakterien verantwortlich, die Nitrile als alleinige Stickstoff- und Kohlenstoffquelle nutzen können; gemeinsam könnten sie als Alternative zu Nitrilasen fungieren, die Nitrile ohne Bildung eines intermediären primären Amids hydrolysieren.

Quellen

Eine große Zahl von NHasen wurde in unterschiedlichen Mikroorganismen nachgewiesen. Das Kollektiv der bekannten mesophilen NHase-produzierenden Mikroorganismen wird von der Gattung Rhodococcus dominiert; bislang wurden lediglich fünf thermophile NHase-produzierende Organismen beschrieben. Verschiedene NHase-Untergruppen weisen erhebliche Unterschiede hinsichtlich Herkunft, Stabilität, Kofaktoranforderungen und katalytischer Eigenschaften auf, während zugleich eine hohe Ähnlichkeit bezüglich Größe und Proteinsequenz zwischen diesen Enzymen besteht. Eine Genomsequenz des Choanoflagellaten Monosiga brevicollis könnte für eine NHase kodieren; das Gen von Monosiga brevicollis umfasste sowohl die α- als auch die β-Untereinheit, die zu einem einzelnen Gen fusioniert sind. Ähnliche NHase-Gene, die aus einer Fusion der α- und β-Untereinheiten bestehen, wurden auch in mehreren eukaryotischen Supergruppen identifiziert, was darauf hindeutet, dass solche NHasen bereits im letzten gemeinsamen Vorfahren aller Eukaryoten vorhanden waren.

Molekularstruktur

NHasen bestehen aus α- und β-Untereinheiten, die in ihrer Aminosäuresequenz nicht miteinander verwandt sind, liegen als αβ-Dimere oder α₂β₂-Tetramere vor und binden pro αβ-Einheit ein Metallatom. Die Bestimmung der 3D-Strukturen zahlreicher NHasen zeigt, dass die α-Untereinheit aus einem langen, ausgedehnten N-terminalen Arm mit zwei α-Helices sowie einer C-terminalen Domäne mit einer ungewöhnlichen, vierlagigen Struktur besteht. Die β-Untereinheit umfasst eine lange N-terminale Schleife, die sich um die α-Untereinheit legt, eine helikale Domäne, die mit der N-terminalen Domäne der α-Untereinheit packt, sowie eine C-terminale Domäne mit einem β-Roll und einer kurzen Helix. Es wurde festgestellt, dass NHase sowohl in αβ- als auch in α₂β₂-Formen vorkommt; in vitro-Massenspektrometrie-Experimente zeigen zudem, dass sich α- und β-Untereinheiten zunächst zu einem αβ-Dimer assemblieren können, das anschließend zur Bildung eines Tetramers interagiert.

Metallkofaktor

In der Biochemie liegt Cobalt üblicherweise in einem Corrinring vor; NHase gehört zu den seltenen Enzymtypen, die Cobalt in nicht-corrinoider Form nutzen. Obwohl eine Cobalt-Permease, die Cobalt über die Zellmembran transportiert, identifiziert wurde, ist der Mechanismus, über den Cobalt ohne Auslösung toxischer Effekte zur NHase gelangt, weiterhin unklar. Das Vorhandensein der Aminosäuresequenz VCTLC weist auf eine Co-zentrierte NHase hin, während das Auftreten von VCSLC eine Fe-zentrierte NHase anzeigt. Die Identität des Metalls im aktiven Zentrum einer NHase kann durch Analyse der Sequenzdaten der α-Untereinheit in der Region, in der das Metall gebunden ist, vorhergesagt werden.

Mechanismus

Das Metallzentrum befindet sich in der zentralen Kavität an der Grenzfläche zwischen den beiden Untereinheiten, und sämtliche Proteinliganden des Metallatoms werden von der α-Untereinheit bereitgestellt. Zwei Carboxamido-Stickstoffe, ein Cystein-Schwefel sowie zwei Schwefelatome aus den jeweiligen Cystein-sulfenischen (Cys-SO) und Cystein-sulfinischen (Cys-SO₂) Säuregruppen bilden die Donor-Umgebung um das Metallzentrum der NHase. Das Metallion ist oktaedrisch koordiniert, wobei die Proteinliganden fünf Eckpositionen des Oktaeders besetzen. Die sechste Position wird entweder durch NO oder durch einen lösungsmittelaustauschbaren Liganden (Hydroxid oder Wasser) eingenommen. Die Bindung von NO an der sechsten Position des Eisen(III)-Zentrums kann die Enzymaktivität modulieren; zugleich wird angenommen, dass ein metallgebundenes Hydroxid zur Hydratisierung von Nitrilen beitragen könnte. Die beiden an das Metall koordinierten Cys-Reste werden posttranslational zu Cys-sulfinischen (Cys-SO₂) und Cys-sulfenischen (Cys-SO) Säuren modifiziert. Quantenchemische Studien sagen voraus, dass der Cys-SO-Rest entweder als Base zur Aktivierung eines nukleophilen Wassermoleküls oder als Nukleophil fungieren könnte. Struktur- und spektroskopische Untersuchungen an Eisen(III)- und Cobalt(III)-Komplexen haben gezeigt, dass die ungewöhnliche Koordinationsstruktur der Metall(III)-Bindungsstelle deren Potenzial erhöhen, jegliche Redoxaktivität unterdrücken, die NO-Bindung an der sechsten Position sowie die oxidative Modifikation der gebundenen S-Donoren ermöglichen und zudem den pK_a-Wert des metallgebundenen Wassers in die Nähe von 7 verschieben kann.

Industrielle Anwendungen

NHase wird seit Langem effizient in der industriellen Herstellung von Acrylamid aus Acrylnitril im Umfang von 600.000 Tonnen pro Jahr eingesetzt; dies stellt das erste erfolgreiche Beispiel eines Biotransformationsprozesses zur Herstellung eines Basischemikalienprodukts dar. NHasen wurden zudem zur Entfernung von Nitrilen aus Abwässern eingesetzt. NHasen, bei denen Stickstoffmonoxid (NO) an das Eisenzentrum gebunden ist, sind intrinsisch lichtempfindlich und können durch Photodissoziation aktiviert werden. Nicotinamid wird industriell durch Hydrolyse von 3-Cyanpyridin unter Katalyse der Nitrilhydratase aus Rhodococcus rhodochrous J1 hergestellt; dabei werden gleichzeitig 3.500 Tonnen Nicotinamid pro Jahr für den Einsatz in Tierfuttermitteln erzeugt.

Literatur