Nitrilase

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Einführung

Nitrilase-Enzyme (Nitrilasen) sind verantwortlich für die Katalyse der Hydrolyse von Nitril (R-CN) Verbindungen in Carbonsäuren und Ammoniak. Nitrilasen sind weit verbreitet und wurden in Pflanzen, Bakterien und Pilzen identifiziert und charakterisiert, und Homologe wurden auch in den Genomen von Hefen und Tieren gefunden. Seit die Enzymaktivität erstmals 1958 in Pflanzen und 1964 in Bakterien identifiziert wurde, wurden mehr als 30 Nitrilase-Enzyme charakterisiert.

Der Zweck der Identifizierung der meisten bakteriellen Nitrilasen besteht jedoch darin, neue Mechanismen der chemischen Synthese oder Zersetzung zu erhellen, anstatt ihre Funktionen in der Natur zu studieren, sodass viele der biologischen Effekte der Enzyme noch unbekannt sind. Glücklicherweise wurden inzwischen immer mehr Enzyme identifiziert, und ihre Substrate und Expressionsmuster wurden ebenfalls bestimmt, sodass Hinweise auf ihre biologischen Effekte langsam offenbart wurden. Nitrilverbindungen sind besonders in Pflanzenumgebungen reichlich vorhanden. Eine große Menge an Beweisen zeigt, dass mikrobielle Nitrilase ein wichtiger Bestandteil des Mechanismus zur Förderung der mikrobiellen Kolonisation von Pflanzen ist, was eine wichtige Rolle bei der Synthese von Pflanzenhormonen, der Stickstoffnutzung und der Entgiftung von Nitrilen und Cyaniden spielen kann. Daher kann ein tieferes Verständnis von Nitrilase und ihrer Rolle in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen erhebliche Vorteile für eine Reihe von biotechnologischen Anwendungen haben, einschließlich der Förderung des Pflanzenwachstums, der Unterstützung der Bioremediation und der Krankheitskontrolle.

Die Nitrilase-Superfamilie

Die Nitrilase-Superfamilie (auch bekannt als CN-Hydrolasen) besteht aus Enzymen, die die Hydrolyse von nicht-peptidischen Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen katalysieren. Die Mitglieder dieser Superfamilie sind in 13 Zweige unterteilt, basierend auf ihrer katalytischen Aktivität und Sequenzidentität, einschließlich aliphatischer Amidase, N-terminaler Amidase, Carbamylase, Biotinidase und Nitrilase, unter anderem. Diese Enzyme sind verantwortlich für die Hydrolyse der CN-Gruppe in der Nitrilverbindung, die Synthese der entsprechenden Carbonsäure und die Freisetzung von Ammoniak. Die von Nitrilase katalysierte Reaktion ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1. Die Nitrilase-Reaktion. Nitrilasen katalysieren die Hydrolyse von Nitrilen zu der entsprechenden Carbonsäure plus Ammoniak (Howden, A.J.M.; Preston, G.M. 2009)

Der Nitrilase-Zweig enthält auch die eng verwandten Cyanid-Dihydratase- und Cyanid-Hydratase-Enzyme. Der Nitrilase-Zweig kann von anderen Mitgliedern der Superfamilie durch das konservierte Cystein-Tryptophan-Glutamat-Motiv unterschieden werden, das sich an den Cystein-Resten des katalytischen Trios befindet. Dieses Cystein-Rest wird als aktiver Ort des Enzyms betrachtet und könnte der Ort sein, an dem Substratgruppen vor der Hydrolyse anhaften. Nitrilasen können allgemein in drei Kategorien basierend auf der Substratspezifität unterteilt werden: aliphatische Nitrilase, aromatische und heterocyclische Nitrilasen sowie Arylacetonitrilasen. Beispiele für jede Art von Nitrilverbindung sind in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2. Beispiele für Nitrilverbindungen (Howden, A.J.M.; Preston, G.M. 2009)

Einige Nitrilase-Enzyme haben eine extrem hohe Substratspezifität, wie die Nitrilase von Klebsiella pneumoniae sp. ozaenae. Einige andere Enzyme haben ein breites Spektrum an Substraten, wie die Nitrilase von Bacillus pallidus Dac521, die aliphatische, aromatische und heterocyclische Nitrile hydrolysieren kann. Nitrilasen mit derselben Substratspezifität zeigen normalerweise Ähnlichkeiten in der Aminosäuresequenz und können in phylogenetischen Analysen zur gleichen Klade gehören (Abbildung 3).

Abbildung 3. Strenger Konsensbaum der charakterisierten Nitrilasen (Howden, A.J.M.; Preston, G.M. 2009)

Industrielle Anwendungen von Nitrilasen

Nitrilasen können zur Synthese industriell wichtiger Carbonsäuren verwendet werden, während andere Carbonsäuren durch chemische Methoden unter extremen Temperatur- und pH-Bedingungen produziert werden. Nitrilasen können auch zur Bioremediation von Böden und Wasserressourcen eingesetzt werden, die mit toxischen Nitrilverbindungen kontaminiert sind. Nitrilverbindungen wie Bromoxynil können als Herbizide verwendet werden, und Cyanid wird in der Kunststoffherstellung und der Gewinnung von Edelmetallen eingesetzt und während des Bergbaus, der Metallverarbeitung und anderer Prozesse in die Umwelt freigesetzt. Aufgrund der hervorragenden Eigenschaften zur Abbau von Cyanid und der Fähigkeit, hohe Konzentrationen von KCN zu tolerieren, wurde die Cyanid-Dihydratase von Pseudomonas stutzeri intensiv untersucht. Die Nitrilase von K. pneumoniae sp. ozaenae ist hochspezifisch für das Herbizid Bromoxynil, das in Pflanzen exprimiert wurde und transgenen Linien Herbizidresistenz verleiht.

Obwohl Nitrilasen großes Potenzial haben, ist es schwierig, das Enzym zu identifizieren und zu charakterisieren. Kürzlich haben Wissenschaftler eine Hochdurchsatzstrategie zur Identifizierung bakterieller Nitrilasen entwickelt. DNA-Proben aus der Umwelt werden in bakterielle Expressionsvektoren transformiert und auf Nitrilase-Aktivität gescreent. Die Verfügbarkeit von Genomsequenzdaten hilft auch, neue Nitrilase-Enzyme zu entdecken. Beispielsweise wurden genomische Sequenzdaten verwendet, um eine funktionelle Nitrilase aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. zu identifizieren.