Nitrilase

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Einleitung

Nitrilase-Enzyme (Nitrilasen) katalysieren die Hydrolyse von Nitrilverbindungen (R‑CN) zu Carbonsäuren und Ammoniak. Nitrilasen sind weit verbreitet und wurden in Pflanzen, Bakterien und Pilzen identifiziert und charakterisiert; Homologe wurden zudem in den Genomen von Hefen und Tieren gefunden. Seit die Enzymaktivität 1958 erstmals in Pflanzen und 1964 in Bakterien nachgewiesen wurde, sind mehr als 30 Nitrilase-Enzyme charakterisiert worden.

Der Zweck der Identifizierung der meisten bakteriellen Nitrilasen besteht jedoch darin, neue Mechanismen der chemischen Synthese oder des Abbaus aufzuklären, und nicht darin, ihre Funktionen in der Natur zu untersuchen; daher sind viele der biologischen Effekte dieser Enzyme weiterhin unbekannt. Inzwischen wurden glücklicherweise immer mehr Enzyme identifiziert, und auch ihre Substrate sowie Expressionsmuster wurden bestimmt, sodass sich Hinweise auf ihre biologischen Wirkungen nach und nach erschließen. Nitrilverbindungen sind insbesondere in pflanzlichen Umgebungen reichlich vorhanden. Umfangreiche Evidenz zeigt, dass mikrobielle Nitrilasen ein wichtiger Bestandteil der Mechanismen sind, die die mikrobielle Kolonisierung von Pflanzen fördern, und dass sie eine bedeutende Rolle bei der Synthese von Pflanzenhormonen, der Stickstoffverwertung sowie der Detoxifikation von Nitrilen und Cyaniden spielen können. Ein vertieftes Verständnis der Nitrilasen und ihrer Rolle in Pflanzen‑Mikroben‑Interaktionen kann daher erhebliche Vorteile für eine Reihe biotechnologischer Anwendungen bieten, darunter die Förderung des Pflanzenwachstums, die Unterstützung der Bioremediation sowie die Krankheitskontrolle.

Die Nitrilase-Superfamilie

Die Nitrilase-Superfamilie (auch als CN‑Hydrolasen bezeichnet) umfasst Enzyme, die die Hydrolyse nichtpeptidischer Kohlenstoff‑Stickstoff‑Bindungen katalysieren. Die Mitglieder dieser Superfamilie werden entsprechend ihrer katalytischen Aktivität und Sequenzidentität in 13 Zweige eingeteilt, darunter u. a. aliphatische Amidase, N‑terminale Amidase, Carbamylase, Biotinidase und Nitrilase. Diese Enzyme hydrolysieren die CN‑Gruppe in Nitrilverbindungen, bilden die entsprechende Carbonsäure und setzen Ammoniak frei. Die durch Nitrilasen katalysierte Reaktion ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1. Die Nitrilase-Reaktion. Nitrilasen katalysieren die Hydrolyse von Nitrilen zur entsprechenden Carbonsäure plus Ammoniak (Howden, A.J.M.; Preston, G.M. 2009)

Der Nitrilase-Zweig umfasst auch die eng verwandten Enzyme Cyanid-Dihydratase und Cyanid-Hydratase. Nitrilasen lassen sich von anderen Mitgliedern der Superfamilie durch das konservierte Cystein‑Tryptophan‑Glutamat‑Motiv unterscheiden, das an den Cysteinresten der katalytischen Triade lokalisiert ist. Dieser Cysteinrest gilt als aktives Zentrum des Enzyms und könnte die Stelle sein, an die Substratgruppen vor der Hydrolyse binden. Nitrilasen lassen sich anhand ihrer Substratspezifität im Allgemeinen in drei Kategorien einteilen: aliphatische Nitrilasen, aromatische und heterozyklische Nitrilasen sowie Arylacetonitrilasen. Beispiele für jede Art von Nitrilverbindung sind in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2. Beispiele für Nitrilverbindungen (Howden, A.J.M.; Preston, G.M. 2009)

Einige Nitrilase-Enzyme weisen eine extrem hohe Substratspezifität auf, wie z. B. die Nitrilase von Klebsiella pneumoniae sp. ozaenae. Andere Enzyme besitzen ein breites Substratspektrum, wie etwa die Nitrilase von Bacillus pallidus Dac521, die aliphatische, aromatische und heterozyklische Nitrile hydrolysieren kann. Nitrilasen mit gleicher Substratspezifität zeigen in der Regel eine Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz und können in phylogenetischen Analysen demselben Klade zugeordnet werden (Abbildung 3).

Abbildung 3. Strenger Konsensusbaum charakterisierter Nitrilasen (Howden, A.J.M.; Preston, G.M. 2009)

Industrielle Anwendungen von Nitrilasen

Nitrilasen können zur Synthese industriell wichtiger Carbonsäuren eingesetzt werden; andere Carbonsäuren werden mittels chemischer Verfahren unter extremen Temperatur- und pH-Bedingungen hergestellt. Nitrilasen können zudem zur Bioremediation von Boden- und Wasserressourcen verwendet werden, die mit toxischen Nitrilverbindungen kontaminiert sind. Nitrilverbindungen wie Bromoxynil werden als Herbizide eingesetzt; Cyanid wird in der Kunststoffherstellung und bei der Gewinnung von Edelmetallen verwendet und gelangt im Rahmen von Bergbau, Metallveredelung und weiteren Prozessen in die Umwelt. Aufgrund der hervorragenden Eigenschaften beim Cyanidabbau und der Fähigkeit, hohe KCN-Konzentrationen zu tolerieren, wurde die Cyanid-Dihydratase von Pseudomonas stutzeri eingehend untersucht. Die Nitrilase von K. pneumoniae sp. ozaenae ist hochspezifisch für das Herbizid Bromoxynil, wurde in Pflanzen exprimiert und verleiht transgenen Linien Herbizidresistenz.

Obwohl Nitrilasen ein großes Potenzial besitzen, ist die Identifizierung und Charakterisierung der Enzyme anspruchsvoll. In jüngerer Zeit wurde eine Hochdurchsatzstrategie zur Identifizierung bakterieller Nitrilasen entwickelt. DNA-Proben aus der Umwelt werden in bakterielle Expressionsvektoren überführt und auf Nitrilase-Aktivität gescreent. Die Verfügbarkeit genomischer Sequenzdaten unterstützt ebenfalls die Entdeckung neuer Nitrilase-Enzyme. So wurden beispielsweise genomische Sequenzdaten genutzt, um eine funktionelle Nitrilase aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. zu identifizieren.