Nitroreductase

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Einführung

Die Enzym-Superfamilie umfasst homologe Enzyme, die bestimmte selektive Eigenschaften des aktiven Zentrums und bestimmte mechanische Merkmale teilen, jedoch verschiedene Funktionen aufweisen. Das Verständnis der funktionalen Unterschiede innerhalb der Superfamilie ist ein tiefgreifendes Problem in den grundlegenden biologischen Wissenschaften. Entwickeln sich die Funktionen von Enzymen in einer sequenziellen Weise, die durch die adaptiven Anforderungen der Stoffwechselwege, in denen sie wirken, getrieben wird? Es ist sehr schwierig, den Mechanismus der funktionalen Differenzierung der Enzym-Superfamilie zu erhellen, da dieser Prozess in einer evolutionären Geschichte stattfand, die sich über etwa Milliarden von Jahren erstreckt.

Eine Enzym-Superfamilie besteht normalerweise aus vielen verschiedenen funktionalen Familien. Die Sequenzen der funktionalen Familien sind sehr unterschiedlich. Die paarweise Sequenzidentität kann weniger als 10 % betragen, und die vorhandenen Sequenzinformationen sind weit verstreut. Darüber hinaus bleiben die überwiegende Mehrheit der Enzyme in einer Superfamilie uncharakterisiert. Eine Superfamilie enthält normalerweise mehr als 20.000 Sequenzen, und die Untersuchung dieses großen Datensatzes mit erheblicher Vielfalt erfordert fortschrittlichere Technologien.

Später lösten Wissenschaftler durch bioinformatische Analysen diese Probleme der diversifizierten Flavinmononukleotid (FMN) abhängigen Nitroreductase (NTR) Superfamilie. Die NTR-Superfamilie ist eine alte Superfamilie mit einem evolutionären Alter von etwa 2,5 Milliarden Jahren und enthält mehr als 20.000 Sequenzen. Diese Familie ist nach der Nitroreduktionsreaktion benannt, die vor Jahrzehnten erstmals charakterisiert wurde. Darüber hinaus kann die NTR-Superfamilie neben der Nitroreduktion auch eine Vielzahl von Reaktionen katalysieren, einschließlich Dehydrierung, Dehalogenierung und Flavinfragmentierung, usw.

NTR bildet eine α+β-Faltung und bindet nicht-kovalent an die Mehrheit des Flavins. NTRs sind typischerweise Homodimere, die aus zwei Monomer-Untereinheiten bestehen. An der Dimeroberfläche werden zwei FMN-bindende aktive Stellen gebildet. Beide Monomere sind wichtig für die aktiven Stellen (Abbildung 1A). Im Vergleich zu anderen Flavin-bindenden Proteinen ist die Dimerisierung für die FMN-Bindung und die enzymatische Funktion in der NTR-Superfamilie unerlässlich. NTR verwendet normalerweise den Ping-Pong-Bi-Bi-Redoxreaktionsmechanismus, wobei das Nicotinamid-Kofaktor verwendet wird, um Elektronen an das gebundene FMN zu liefern und diese dann an den nachgeschalteten Elektronenakzeptor in der Reduktions-Halbreaktion zu übertragen (Abbildung 1B und C).

Abbildung 1. Eine Übersicht über die Struktur und Reaktionsvielfalt der NTR-Superfamilie (Akiva, E.; et al. 2017)

Eine globale Sicht auf die Sequenzvielfalt innerhalb der NTR-Superfamilie

Um die Sequenzvielfalt innerhalb der NTR-Superfamilie zu untersuchen, sammelten Wissenschaftler eine Menge nicht redundanter aller verfügbaren Sequenzen und Strukturen, die mit der Superfamilie aus öffentlichen Datenbanken verbunden sind. Der Datensatz enthält 24.270 nicht redundante NTR-Sequenzen, die zwischen 150 und 1.580 aa lang sind. Die Ähnlichkeit zwischen all diesen Sequenzen wird durch die Verwendung von "all-vs.-all" BLAST berechnet, und SSN wird verwendet, um die Ergebnisinformationen zu visualisieren.  

Die SSN in Abbildung 2 zeigt Knoten (Kreise), die Sequenzsätze präsentieren, die >60 % paarweise Sequenzidentität teilen; dieses Maß an Ähnlichkeit stellt sicher, dass die Sequenzen innerhalb eines einzelnen repräsentativen Knotens mit statistischer Signifikanz ausgerichtet werden können und die gesamte Superfamilie visualisiert wird. Ein Identitätsniveau von 60 % kann jedoch auch Enzyme mit unterschiedlichen Funktionen innerhalb eines einzelnen repräsentativen Knotens zusammenfassen.

Abbildung 2. Eine repräsentative SSN der NTR-Superfamilie (Akiva, E.; et al. 2017)

Die funktionale Vielfalt der NTR-Superfamilie bleibt unbekannt

Viele Studien haben sich auf die eingehende biochemische und strukturelle Charakterisierung ausgewählter weniger Mitglieder der Superfamilie konzentriert, aber umfassende Analysen der Bioinformatik haben gezeigt, dass bis zu 99 % der Enzyme in der NTR-Superfamilie nicht experimentell charakterisiert wurden. Darüber hinaus ist der Anteil der Sequenzen mit funktionalen und/oder strukturellen Informationen in verschiedenen Untergruppen ungleichmäßig. Zum Beispiel sind nur wenige Sequenzen in der SagB-Untergruppe charakterisiert. Diese Untergruppe ist groß und vielfältig (mit einer durchschnittlichen Sequenzidentität von weniger als 32 %) und könnte kleinere "Sub-Subgruppen (SSGs) mit unterschiedlichen Substrat- und Katalysespezifitäten" enthalten. Ähnlich wird eine durchschnittliche Sequenzidentität von weniger als 40 % in den Untergruppen NfsA und NfsB beobachtet. Derzeit wurden 18 der 2.632 Sequenzen der NfsB-Untergruppe und 20 der 2.299 Sequenzen der NfsA-Untergruppe charakterisiert, was etwa 1 % des Gesamtanteils entspricht.