Nitroreduktase

Verwandte Lektüre

Einleitung

Die Enzym-Superfamilie umfasst homologe Enzyme; sie teilen bestimmte selektive Merkmale des aktiven Zentrums sowie bestimmte mechanistische Eigenschaften, weisen jedoch unterschiedliche Funktionen auf. Das Verständnis der funktionellen Unterschiede innerhalb der Superfamilie stellt eine grundlegende Fragestellung der biologischen Grundlagenforschung dar. Entwickeln sich Enzymfunktionen sequenziell, getrieben durch die adaptiven Anforderungen der Stoffwechselwege, in denen sie wirken? Die Aufklärung des Mechanismus der funktionellen Differenzierung einer Enzym-Superfamilie ist sehr schwierig, da dieser Prozess über eine Evolutionsgeschichte von etwa Milliarden Jahren stattgefunden hat.

Eine Enzym-Superfamilie setzt sich in der Regel aus vielen unterschiedlichen funktionellen Familien zusammen. Die Sequenzen der funktionellen Familien unterscheiden sich stark. Die paarweise Sequenzidentität kann unter 10% liegen, und die vorhandenen Sequenzinformationen sind breit verstreut. Zudem bleibt die überwiegende Mehrheit der Enzyme einer Superfamilie uncharakterisiert. Eine Superfamilie umfasst üblicherweise mehr als 20.000 Sequenzen, und die Untersuchung dieses großen, hochdiversen Datensatzes erfordert fortgeschrittene Technologien.

Später lösten Wissenschaftler diese Probleme der diversifizierten flavinmononukleotid-(FMN)-abhängigen Nitroreductase-(NTR)-Superfamilie mittels bioinformatischer Analysen. Die NTR-Superfamilie ist eine alte Superfamilie mit einem evolutionären Alter von etwa 2,5 Milliarden Jahren und umfasst mehr als 20.000 Sequenzen. Diese Familie ist nach der Nitroreduktion benannt, die vor Jahrzehnten erstmals charakterisiert wurde. Neben der Nitroreduktion kann die NTR-Superfamilie jedoch auch eine Vielzahl weiterer Reaktionen katalysieren, darunter Dehydrierung, Dehalogenierung und Flavin-Fragmentierung etc.

NTR bildet eine α+β-Faltung aus und bindet überwiegend nicht-kovalent an Flavin. NTRs liegen typischerweise als Homodimere aus zwei Monomer-Untereinheiten vor. An der Dimer-Grenzfläche werden zwei FMN-bindende aktive Zentren gebildet. Beide Monomere sind für die aktiven Zentren wichtig (Abbildung 1A). Im Vergleich zu anderen Flavin-bindenden Proteinen ist die Dimerisierung in der NTR-Superfamilie essenziell für die FMN-Bindung und die enzymatische Funktion. NTR folgt üblicherweise dem Ping-Pong-Bi-Bi-Redoxreaktionsmechanismus, wobei ein Nicotinamid-Kofaktor Elektronen an das gebundene FMN liefert, die in der Reduktions-Halbreaktion anschließend auf den nachgeschalteten Elektronenakzeptor übertragen werden (Abbildung 1B und C).

Abbildung 1. Überblick über Struktur und Reaktionsdiversität der NTR-Superfamilie (Akiva, E.; et al. 2017)

Eine globale Sicht auf die Sequenzdiversität innerhalb der NTR-Superfamilie

Um die Sequenzdiversität innerhalb der NTR-Superfamilie zu untersuchen, stellten Wissenschaftler aus öffentlichen Datenbanken einen Satz nicht-redundanter, aller verfügbaren Sequenzen und Strukturen zusammen, die mit der Superfamilie assoziiert sind. Der Datensatz umfasst 24.270 nicht-redundante NTR-Sequenzen mit einer Länge zwischen 150 und 1.580 aa. Die Ähnlichkeit zwischen all diesen Sequenzen wird mittels „all-vs.-all“-BLAST berechnet, und zur Visualisierung der Ergebnisinformationen wird ein SSN verwendet. 

Das SSN in Abbildung 2 zeigt Knoten (Kreise), die Sequenzsets repräsentieren, die eine paarweise Sequenzidentität von >60% teilen; dieses Ähnlichkeitsniveau stellt sicher, dass die Sequenzen innerhalb eines einzelnen repräsentativen Knotens mit statistischer Signifikanz ausgerichtet werden können und ermöglicht die Visualisierung der gesamten Superfamilie. Ein Identitätsniveau von 60% kann jedoch auch Enzyme mit unterschiedlichen Funktionen innerhalb eines einzelnen repräsentativen Knotens zusammenfassen.

Abbildung 2. Repräsentatives SSN der NTR-Superfamilie (Akiva, E.; et al. 2017)

Die funktionelle Diversität der NTR-Superfamilie ist weiterhin unbekannt

Viele Studien haben sich auf die detaillierte biochemische und strukturelle Charakterisierung einiger weniger ausgewählter Mitglieder der Superfamilie konzentriert, doch umfassende bioinformatische Analysen haben gezeigt, dass bis zu 99% der Enzyme in der NTR-Superfamilie nicht experimentell charakterisiert wurden. Darüber hinaus ist der Anteil der Sequenzen mit funktionellen und/oder strukturellen Informationen in den verschiedenen Untergruppen ungleich verteilt. So sind beispielsweise nur wenige Sequenzen der SagB-Untergruppe charakterisiert. Diese Untergruppe ist groß und divers (mit einer durchschnittlichen Sequenzidentität von weniger als 32%) und kann kleinere „Sub-Subgruppen (SSGs) mit unterschiedlichen Substrat- und katalytischen Spezifitäten“ enthalten. In ähnlicher Weise wird in den Untergruppen NfsA und NfsB eine durchschnittliche Sequenzidentität von weniger als 40% beobachtet. Derzeit wurden 18 der 2.632 Sequenzen der NfsB-Untergruppe und 20 der 2.299 Sequenzen der NfsA-Untergruppe charakterisiert, was etwa 1% der Gesamtzahl entspricht.