Oxalacetat-Decarboxylase

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Klassifizierungen

Die Oxalacetat-Decarboxylase wird in zwei Typen unterteilt: einen zytoplasmatischen Typ und einen Plasmamembran-Typ. Erstere weist keine gekoppelte Natriumionentransportfunktion auf und wurde erstmals in Microcococcus lysodeikticus identifiziert.

Abbildung 1. Struktur der Oxalacetat-Decarboxylase.

Rolle der Oxalacetat-Decarboxylase im Citronensäure-Fermentationsweg

Citronensäure wird über einen gekoppelten Natriumionenexport in das Bakterium aufgenommen und durch die Citrat-Lyase zu Oxalacetat und Essigsäure abgebaut. Oxalacetat wird durch die an der Plasmamembran lokalisierte Oxalacetat-Decarboxylase zu Pyruvat decarboxyliert, wobei die Decarboxylierungsreaktion den Export von zwei Natriumionen aus der Zelle koppelt. Pyruvat wird anschließend weiter zu Acetyl-Coenzym A und Ameisensäure abgebaut, gefolgt von der Umsetzung von Acetyl-Coenzym A zu Acetylphosphat. In diesem Reaktionsweg ist insbesondere die biosynthetische Reaktion der NADH-Synthese von Bedeutung.

Untereinheiten der Oxalacetat-Decarboxylase

Die Oxalacetat-Decarboxylase besteht aus drei unterschiedlichen Untereinheiten α, β und λ in einem 1:1:1-Verhältnis. Wie in Abbildung 1 dargestellt, enthält die periphere α-Untereinheit (63,5 kU) zwei klar abgegrenzte Strukturdomänen, nämlich die N-terminale Carboxyltransferase-Domäne und die C-terminale Biotin-Bindedomäne. Eine prolin- und alaninreiche Peptidkette verbindet die Biotin-Substitutionsstelle zwischen diesen beiden Strukturdomänen. In einem Abstand von 35 Aminosäureresten vom C-Terminus der Peptidkette ist Biotin kovalent an einen Lysinrest gebunden. Die β-Untereinheit der Oxalacetat-Decarboxylase (44,9 kU) ist stark hydrophob und fest an die Plasmamembran gebunden.

Funktion der Untereinheit

Der katalytische Zyklus der Oxalacetat-Decarboxylase beginnt mit der Bindung von Oxalacetat an die Carboxyltransferase-Domäne der α-Untereinheit, gefolgt von der Übertragung der Carboxylgruppe des Oxalacetats auf Biotin. Dabei bewegt sich das carboxylierte Biotin nach einer Substitution über eine flexible Prolin-Alanin-Kette von der Carboxyltransferase-Stelle der α-Untereinheit zur Decarboxylase-Stelle der β-Untereinheit. Während der Decarboxylierung von Carboxybiotin wird ein extramembranär importiertes Proton verbraucht, während zwei Natriumionen in den periplasmatischen Raum gepumpt werden. Diese Abfolge biochemischer Reaktionen ist eng mit Konformationsänderungen des Proteins verknüpft. So kann beispielsweise der Austausch der Biotin-Komponente zwischen den beiden katalytischen Strukturdomänen für das Öffnen und Schließen der Natriumkanäle verantwortlich sein; diese Konformationsänderungen sind räumlich und zeitlich mit den biochemischen Reaktionen koordiniert und sind entscheidend für die Gesamt-Decarboxylierungsreaktion.

Aufreinigung

Die Oxalacetat-Decarboxylase kann in einem zweistufigen Extraktionsverfahren isoliert und aufgereinigt werden, wobei zunächst ein Detergens zur Solubilisierung des Proteins aus der Membran eingesetzt wird, gefolgt von einer Affinitätschromatographie an einer Agarose-Säule mit dem entsprechenden Antibiotika-Protein. Der Drei-Untereinheiten-Komplex der Oxalacetat-Decarboxylase aus Klebsiella pneumoniae wurde durch induzierte Expression erfolgreich in E. coli synthetisiert, was seine Untersuchung mittels Mutagenese erleichtert; zudem wurden in den Experimenten auch die Zwei-Untereinheiten-Komplexe α_γ und β_γ kloniert, exprimiert und isoliert.

Analyse der topologischen Isomerie der membranständigen β-Untereinheit

Die topologische Analyse von Membranproteinen beschreibt die Anzahl und Orientierung transmembraner Fragmente sowie die Verteilung der C- und N-Termini eines Transmembranproteins. Die β-Untereinheit der Oxalacetat-Decarboxylase ist ein hydrophobes Protein aus 433 Aminosäureresten; eine Hydrophobizitätsanalyse zeigt, dass sie 9 bis 10 Transmembranstrukturen aufweist. In der angenommenen Transmembranregion wurden mehrere Stellen ausgewählt, um die Peptidkette des Zielproteins zu unterbrechen und ein Fusionsprotein mit alkalischer Phosphatase oder β-Galactosidase zu erzeugen; das gesamte Protein wurde hinsichtlich seiner Membranorientierung analysiert, indem die Lokalisation der Fusionsstelle untersucht wurde.