Oxaloacetat-Decarboxylase

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Klassifikationen

Oxaloacetat-Decarboxylase wird in zwei Typen unterteilt: zytoplasmatische und plasmamembranäre Typen. Letzterer hat keine gekoppelte Natriumionentransportfunktion und wurde erstmals in Micrococcus lysodeikticus identifiziert.

Abbildung 1. Struktur der Oxaloacetat-Decarboxylase.

Rolle der Oxaloacetat-Decarboxylase im Zitronensäurefermentationsweg

Zitronensäure wird durch gekoppelte Natriumionenexport in das Bakterium aufgenommen und durch Citratlyase zu Oxaloacetat und Essigsäure abgebaut. Oxaloacetat wird durch Oxaloacetat-Decarboxylase an der Plasmamembran decarboxyliert, um Pyruvat zu produzieren, während die Decarboxylierungsreaktion zwei Natriumionen für den Export nach außen koppelt. Pyruvat wird weiter zu Acetyl-Coenzym A und Ameisensäure abgebaut, gefolgt von der Reaktion von Acetyl-Coenzym A zur Bildung von Acetylphosphat. In diesem Reaktionsweg ist die Biosynthesereaktion der NADH-Synthese besonders wichtig.

Untereinheiten der Oxaloacetat-Decarboxylase

Die Oxaloacetat-Decarboxylase besteht aus drei verschiedenen Untereinheiten α, β und λ im Verhältnis 1:1:1. Wie in Abbildung 1 gezeigt, enthält die periphere α-Unterheit (63,5 ku) zwei unterschiedliche strukturelle Domänen, nämlich die N-terminale Carboxyltransferase-Domäne und die C-terminale Biotin-Bindungsdomäne. Eine prolin- und alaninreiche Peptidkette verbindet die Biotin-Substitution zwischen diesen beiden strukturellen Domänen. An 35 Aminosäureresten vom C-Terminus der Peptidkette ist Biotin kovalent an einen Lysinrest gebunden. Die β-Unterheit der Oxaloacetat-Decarboxylase (44,9 ku) ist stark hydrophob und eng an die Plasmamembran gebunden.

Funktion der Untereinheit

Der katalytische Zyklus der Oxaloacetat-Decarboxylase beginnt mit der Bindung von Oxaloacetat an die Carboxyltransferase-Domäne der α-Unterheit, gefolgt vom Transfer der Carboxylgruppe von Oxaloacetat zu Biotin, wobei das carboxylierte Biotin nach einer duktilen Prolin-Alanin-Kettenersetzung von der Carboxyltransferstelle der α-Unterheit zur Decarboxylase-Stelle der β-Unterheit wandert. Während der Decarboxylierung von Carboxybiotin wird ein extramembranär importiertes Proton verbraucht, während zwei Natriumionen in den periplasmatischen Raum gepumpt werden. Diese Reihe biochemischer Reaktionen steht in engem Zusammenhang mit den konformationellen Veränderungen des Proteins. Zum Beispiel könnte der Austausch der Biotin-Komponente zwischen den beiden katalytischen strukturellen Domänen für das Öffnen und Schließen der Natriumkanäle verantwortlich sein, und diese konformationellen Veränderungen sind räumlich und zeitlich mit den biochemischen Reaktionen koordiniert und sind entscheidend für die gesamte Decarboxylierungsreaktion.

Purifikation

Die Oxaloacetat-Decarboxylase kann in einem zweistufigen Extraktionsprozess isoliert und gereinigt werden, wobei ein Detergens verwendet wird, um das Protein von der Membran zu lysieren, gefolgt von einer Affinitätschromatographie an einer Agarose-Säule mit dem entsprechenden Antibiotika-Protein. Der Dreieinheit-Komplex der Klebsiella pneumoniae Oxaloacetat-Decarboxylase wurde erfolgreich in E. coli durch induzierte Expression synthetisiert, was die Untersuchung durch Mutagenese erleichtert, und die zwei-Einheit-Komplexe α_γ und β_γ wurden ebenfalls im Experiment kloniert, exprimiert und isoliert.

Analyse des topologischen Isomerismus der Membran-β-Unterheit

Die topologische Analyse von Membranproteinen beschreibt die Anzahl und Orientierung der transmembranären Fragmente sowie die C- und N-terminale Verteilung eines transmembranären Proteins. Die β-Unterheit der Oxaloacetat-Decarboxylase ist ein hydrophobes Protein, das aus 433 Aminosäureresten besteht, und die hydrophobe Analyse zeigt, dass es 9 bis 10 transmembranäre Strukturen hat. Im vermuteten transmembranären Bereich wurden mehrere Stellen ausgewählt, um die Peptidkette des Zielproteins zu unterbrechen, um ein Fusionsprotein mit alkalischer Phosphatase oder β-Galactosidase zu bilden, und das gesamte Protein wurde über die Membran analysiert, indem der Standort der Fusionsstelle untersucht wurde.