PAD

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Einführung

Histon sind die wesentlichen Bausteine der Chromatin, die als Gerüst der DNA in Eukaryoten dienen. Veränderungen in der Histonstruktur wirken sich direkt auf die Wechselwirkung mit DNA (oder anderen nukleären Proteinen) aus und verändern somit die gesamte Chromatinfunktion. Histone sind stark posttranslational modifiziert (PTM), einschließlich Methylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Ubiquitinierung und Citrullinierung. Unter ihnen ist die Citrullinierung (auch bekannt als Deiminierung) die Hydrolyse von Peptidyl-Arginin zu Peptidyl-Citrullin. Dieser Prozess wird von der Familie der Enzyme der Protein-Arginin-Deiminase (PAD) katalysiert. Eine Überexpression von PAD und eine Hochregulierung der Enzymaktivität wurden in vielen Krankheiten beobachtet, einschließlich rheumatoider Arthritis (RA), Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit, Multipler Sklerose (MS) und Krebs, usw.

Bei Menschen besteht die PAD-Familie aus fünf calciumabhängigen Isoenzymen (PADs 1-4 und 6), die etwa 50 % Sequenzähnlichkeit aufweisen. PAD wird in einer großen Anzahl von Zellen und Geweben exprimiert, einschließlich Epidermis und Gebärmutter (PAD1), Skelettmuskulatur, Gehirn, Entzündungszellen und sekretorischen Drüsen (PAD2), Haarfollikeln und Keratinozyten (PAD3), Granulozyten und mehreren Krebsarten (PAD4) sowie Oozyten und Embryonen (PAD6). PAD4 ist das einzige Isoenzym, das nachweislich eine Rolle bei der Histondeiminierung spielt, obwohl neuere Berichte darauf hindeuten, dass PAD2 ebenfalls Histone deiminieren kann. Neueste Studien haben gezeigt, dass PAD neben dem Zytoplasma und dem Zellkern auch in Granula und Mitochondrien existieren kann, wie PAD4 und PAD2.

Derzeit gibt es Hinweise darauf, dass Fibrinogen, Aktin und Filaggrin ebenfalls Substrate von PAD sind, und die Citrullinierung dieser Proteine ist bekannt, dass sie bei rheumatoider Arthritis auftritt.

Abbildung 1. PADs katalysieren die Hydrolyse von Peptidyl-Arginin zu Peptidyl-Citrullin (Bicker, K.L.; Thompson, P.R. 2014)

PAD-Struktur und Mechanismus

Viel Arbeit wurde geleistet, um die Struktur von PAD4 mit/ohne Calcium und Substratbindung zu klären. Studien haben gezeigt, dass PAD4 insgesamt fünf Calcium-Bindungsstellen enthält, von denen zwei helfen, die N-terminale und C-terminale Domäne zu verbinden, und die verbleibenden drei Calcium-Bindungsstellen sich in der N-terminalen Domäne befinden. Diese drei Bindungsstellen können weiter in zwei immunoglobulinähnliche Subdomänen unterteilt werden, von denen eine ein nukleares Lokalisationssignal (NLS) enthält. Interessanterweise sind die Reste 158-171 der N-terminalen Domäne in der calciumfreien Form stark ungeordnet, bilden jedoch in Anwesenheit von Calcium eine hochgeordnete α-Helix. Wissenschaftler spekulieren, dass diese konformationale Änderung die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Enzymen reguliert. In der C-terminalen Domäne induziert die Calciumbindung eine konformationale Verschiebung, die wiederum die aktive Stelle erzeugt.

Heutzutage wurde viel Arbeit am katalytischen Mechanismus von PAD geleistet. Diese Arbeiten haben gezeigt, dass PAD einen umgekehrten Protonierungsmechanismus verwendet, bei dem das aktive Nukleophil Cys645 in PAD4 in der aktiven Form des Enzyms als Thiolat existiert. His471, ein weiterer wichtiger Rest in der aktiven Stelle, fördert die anfängliche Freisetzung von Ammoniak aus der Guanidinngruppe des Substrats und aktiviert dann ein Wassermolekül, um die Hydrolyse des Substrats abzuschließen. Studien zu PAD 1 und 3 haben ebenfalls bestätigt, dass sie ebenfalls durch einen ähnlichen umgekehrten Protonierungsmechanismus ablaufen.

Abbildung 2. Die vorgeschlagenen Mechanismen der PAD-Inaktivierung durch halo-acetamidinbasierte Inhibitoren (Bicker, K.L.; Thompson, P.R. 2014)

Entwicklung neuer PAD-Inhibitoren

Obwohl mehrere reversible PAD-Inhibitoren identifiziert wurden (zum Beispiel Taxol, Streptomycin und Minocyclin), sind diese Verbindungen relativ schwache PAD-Inhibitoren, und die bisher beschriebenen effektivsten Inhibitoren modifizieren die Enzyme irreversibel. Die mangelnde Wirksamkeit reversibler Inhibitoren könnte mit der kleinen aktiven Stelle zusammenhängen, die nur die Seitenkette von Arginin-Resten aufnehmen kann, wenn das Enzym an Calcium bindet. Aufgrund der mangelnden Wirksamkeit reversibler Inhibitoren haben Wissenschaftler ihre Bemühungen auf die Entwicklung von Cl-Amidin-Analoga mit verbesserter Potenz, Selektivität und Bioverfügbarkeit konzentriert. Mehrere neue PAD-Inhibitoren wurden auch unter Verwendung von Bibliotheksansätzen identifiziert. Zum Beispiel wurde eine relativ kleine Bibliothek von 264 Verbindungen in der festen Phase synthetisiert und dann gescreent, um PAD-Inhibitoren zu identifizieren. Diese Methode identifizierte das Tripeptid (Thr-Asp-F-amidin; TDFA) als einen hochselektiven (bis zu 65-fach) PAD4-Inhibitor mit ausgezeichneter in vivo Potenz.

Abbildung 3. Struktur, Potenz und Selektivität der nützlichsten PAD-Inhibitoren (Bicker, K.L.; Thompson, P.R. 2014)