PAD

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Einleitung

Histone sind die wesentlichen Bausteine des Chromatins, das in Eukaryoten als Gerüst für die DNA dient. Veränderungen der Histonstruktur beeinflussen unmittelbar die Interaktion mit DNA (oder anderen nukleären Proteinen) und verändern dadurch die Gesamtfunktion des Chromatins. Histone unterliegen in hohem Maße posttranslationalen Modifikationen (PTM), darunter Methylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Ubiquitinierung und Citrullinierung. Die Citrullinierung (auch Deiminierung genannt) ist dabei die Hydrolyse von Peptidyl-Arginin zu Peptidyl-Citrullin. Dieser Prozess wird durch Enzyme der Protein-Arginin-Deiminase(PAD)-Familie katalysiert. Eine Überexpression von PAD sowie eine Hochregulation der Enzymaktivität wurden bei zahlreichen Erkrankungen beobachtet, darunter rheumatoide Arthritis (RA), Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit, Multiple Sklerose (MS) und Krebs usw.

Beim Menschen umfasst die PAD-Familie fünf calciumabhängige Isoenzyme (PAD1–4 und PAD6), die etwa 50 % Sequenzähnlichkeit aufweisen. PAD wird in einer Vielzahl von Zellen und Geweben exprimiert, darunter Epidermis und Uterus (PAD1), Skelettmuskel, Gehirn, Entzündungszellen und sekretorische Drüsen (PAD2), Haarfollikel und Keratinozyten (PAD3), Granulozyten und mehrere Krebsarten (PAD4) sowie Oozyten und Embryonen (PAD6). PAD4 ist das einzige Isoenzym, für das eine Rolle bei der Histon-Deiminierung gezeigt wurde, wenngleich neuere Berichte darauf hindeuten, dass PAD2 ebenfalls Histone deiminieren kann. Aktuelle Studien zeigen zudem, dass PAD neben Zytoplasma und Zellkern auch in Granula und Mitochondrien vorkommen kann, wie beispielsweise PAD4 und PAD2.

Derzeit gibt es Hinweise darauf, dass auch Fibrinogen, Aktin und Filaggrin Substrate von PAD sind; die Citrullinierung dieser Proteine ist aus der rheumatoiden Arthritis bekannt.

Abbildung 1. PADs katalysieren die Hydrolyse von Peptidyl-Arginin zu Peptidyl-Citrullin (Bicker, K.L.; Thompson, P.R. 2014)

PAD-Struktur und -Mechanismus

Es wurden umfangreiche Arbeiten durchgeführt, um die Struktur von PAD4 mit/ohne Calcium sowie mit Substratbindung zu charakterisieren. Studien zeigen, dass PAD4 insgesamt fünf Calcium-Bindungsstellen enthält, von denen zwei zur Überbrückung der N-terminalen und C-terminalen Domänen beitragen; die verbleibenden drei Calcium-Bindungsstellen befinden sich in der N-terminalen Domäne. Diese drei Bindungsstellen lassen sich weiter in zwei immunglobulinähnliche Subdomänen unterteilen, von denen eine ein nukleäres Lokalisationssignal (NLS) enthält. Interessanterweise sind die Aminosäurereste 158–171 der N-terminalen Domäne in der calciumfreien Form stark ungeordnet, bilden jedoch in Anwesenheit von Calcium eine hochgeordnete α-Helix. Es wird angenommen, dass diese Konformationsänderung die Interaktion zwischen Proteinen und Enzymen reguliert. In der C-terminalen Domäne induziert die Calcium-Bindung eine Konformationsverschiebung, die wiederum die Spalte des aktiven Zentrums ausbildet.

Derzeit wurden auch umfangreiche Untersuchungen zum katalytischen Mechanismus von PAD durchgeführt. Diese Arbeiten zeigten, dass PAD einen Mechanismus der umgekehrten Protonierung nutzt, bei dem das Nukleophil im aktiven Zentrum, Cys645 in PAD4, in der aktiven Enzymform als Thiolat vorliegt. His471, ein weiterer wichtiger Rest im aktiven Zentrum, fördert zunächst die Abspaltung von Ammoniak aus der Guanidin-Gruppe des Substrats und aktiviert anschließend ein Wassermolekül, um die Hydrolyse des Substrats zu vervollständigen. Studien zu PAD1 und PAD3 bestätigten ebenfalls, dass diese über einen ähnlichen Mechanismus der umgekehrten Protonierung ablaufen.

Abbildung 2. Vorgeschlagene Mechanismen der PAD-Inaktivierung durch Haloacetamidin-basierte Inhibitoren (Bicker, K.L.; Thompson, P.R. 2014)

Entwicklung neuer PAD-Inhibitoren

Obwohl mehrere reversible PAD-Inhibitoren identifiziert wurden (z. B. Taxol, Streptomycin und Minocyclin), sind diese Verbindungen vergleichsweise schwache PAD-Inhibitoren; die bislang wirksamsten beschriebenen Inhibitoren modifizieren die Enzyme irreversibel. Die geringe Wirksamkeit reversibler Inhibitoren könnte mit der kleinen Kavität des aktiven Zentrums zusammenhängen, die nur die Seitenkette von Argininresten aufnehmen kann, wenn das Enzym an Calcium gebunden ist. Aufgrund der unzureichenden Wirksamkeit reversibler Inhibitoren konzentrierten sich Forschende auf die Entwicklung von Cl-amidin-Analoga mit verbesserter Potenz, Selektivität und Bioverfügbarkeit. Mithilfe von Bibliotheksansätzen wurden zudem mehrere neue PAD-Inhibitoren identifiziert. So wurde beispielsweise eine relativ kleine Bibliothek von 264 Verbindungen in der Festphase synthetisiert und anschließend gescreent, um PAD-Inhibitoren zu identifizieren. Mit dieser Methode wurde das Tripeptid (Thr-Asp-F-amidin; TDFA) als hochselektiver (bis zu 65-fach) PAD4-Inhibitor mit ausgezeichneter in vivo-Wirksamkeit identifiziert.

Abbildung 3. Struktur, Potenz und Selektivität der nützlichsten PAD-Inhibitoren (Bicker, K.L.; Thompson, P.R. 2014)