PNGase F

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Einleitung

Der zelluläre Stoffwechsel umfasst nicht nur niedermolekulare Substanzen, sondern auch die Biosynthese und den Katabolismus von Makromolekülen wie Proteinen, Glykanen und Lipiden. Im Vergleich zur Biosynthese von Makromolekülen ist unser Verständnis ihres Katabolismus begrenzt. So ist die N‑Glykosylierung eine der häufigsten Proteinmodifikationen, die in allen Domänen des Lebens (Eukaryoten, Bakterien oder Archaeen) vorkommt. Obwohl der biosynthetische Weg der N‑Glykosylierung bei Säugetieren und Hefe gut aufgeklärt ist, müssen selbst in dieser „Post‑Genom“-Ära viele Fragen zu ihrem Katabolismus noch geklärt werden. Es ist bekannt, dass der Abbau von N‑Glykoproteinen überwiegend in Lysosomen erfolgt; in jüngerer Zeit wurde jedoch auch das Vorhandensein „nicht‑lysosomaler“ Abbauwege beschrieben. Die zytoplasmatische PNGase (Peptid:N‑Glykanase; NGLY1/Ngly1 beim Menschen bzw. in der Maus) ist ein konserviertes deglykosylierendes Enzym, das am nicht‑lysosomalen Abbau von N‑Glykoproteinen beteiligt ist. PNGase setzt intakte N‑Glykane von Glykoproteinen frei und ist für die Entfernung fehlgefalteter Glykoproteine aus dem Zytoplasma verantwortlich. Aktuelle Forschungsergebnisse zeigen, dass ein NGLY1-Mangel eine genetische Erkrankung des Menschen ist, was die Bedeutung dieses Enzyms für die normale Entwicklung von Säugetieren eindeutig unterstreicht.

Abbildung 1. Beteiligung der zytoplasmatischen PNGase am ER‑assoziierten Abbau (Suzuki, T. 2015)

Die zytoplasmatische PNGase – Verteilung und enzymatische Eigenschaften

PNGase katalysiert die Hydrolyse der Amidbindung zwischen dem innersten N‑Acetylglucosamin (GlcNAc) und einem Asn‑Rest eines N‑Glykoproteins, wodurch ein de‑N‑glykosyliertes Protein sowie ein freies Oligosaccharid mit 1‑Amino‑GlcNAc am reduzierenden Ende entstehen. Bei physiologischem pH wird anschließend spontan Ammoniak vom reduzierenden Ende abgespalten, und es entsteht ein freies Oligosaccharid mit N,N'‑Diacetylchitobiose am reduzierenden Ende.

Abbildung 2. Reaktionsschema für Peptid:N‑Glykanase (Ngly1) (Suzuki, T.; et al. 2016)

Die zytoplasmatische PNGase‑Aktivität bei Säugetieren wurde erstmals in mehreren Zellkulturen beschrieben. Dieses Enzym unterscheidet sich in mehreren enzymatischen Eigenschaften von anderen PNGasen aus Pflanzen (Glycoamidase/PNGase A) oder Bakterien (N‑Glykanase/PNGase F); so benötigt es beispielsweise ein Reduktionsmittel für seine Aktivität und weist bei neutralem pH sein Aktivitätsoptimum auf. Darüber hinaus besitzt Ngly1 intrinsische Kohlenhydrat‑Bindungseigenschaften. Der katalytische Kern der PNGase enthält eine GlcNAc2‑Bindungsstelle, und es liegt eine PAW‑Domäne vor, die als Kohlenhydrat‑Bindungsdomäne für High‑Mannose‑Glykane dient. Demgegenüber wurde gezeigt, dass die N‑terminale PUB‑Domäne als p97‑Bindungsmodul fungiert. Das Gen, das die zytoplasmatische PNGase kodiert, wurde erstmals in der Sprosshefe Saccharomyces cerevisiae identifiziert; seitdem wurden Genorthologe in einer Vielzahl von Eukaryoten einschließlich Säugetieren gefunden. Untersuchungen zur Gewebeverteilung der PNGase im Mauszytoplasma zeigten, dass Ngly1-mRNA in allen untersuchten Geweben weit verbreitet vorhanden war, mit dem höchsten Niveau im Hoden. Im Serum wurde keine entsprechende Aktivität nachgewiesen, was darauf hinweist, dass das Enzym nicht sezerniert wird. Unter den getesteten Organen war die Gesamtaktivität in der Leber am höchsten, während der Thymus die höchste spezifische Aktivität aufwies.

Abbildung 3. Schematische Darstellung der Domänenstruktur der PNGase (Ngly1) aus Mensch, Maus, Hefe und Pilzen (Suzuki, T.; et al.2016)

NGLY1-Mangel

Im Jahr 2012 wurde durch eine Exom‑Analyse eine genetische Erkrankung des Menschen identifiziert, die Mutationen im Genlokus NGLY1 umfasst. Die klinischen Merkmale von 12 Patientinnen und Patienten wurden berichtet, darunter globale Entwicklungsverzögerung, Bewegungsstörung, Hypotonie und fehlende Tränenproduktion. Diese Studien haben die Bedeutung der zytoplasmatischen PNGase eindeutig belegt. Die Details der molekularen Mechanismen, die zur Pathologie des NGLY1-Mangels führen, müssen jedoch weiterhin untersucht werden. Unter Patientinnen und Patienten mit NGLY1-Mangel ist eine Nonsense‑Mutation (c.1201A>T (p.R401X)) das am häufigsten nachgewiesene Allel. Dieses p.R401X‑Allel wurde in 2 von 8598 Chromosomen europäischer Abstammung beobachtet, die in der Ressource Exome Variant Server berichtet wurden. Auf dieser Grundlage wird spekuliert, dass homozygote Mutationen, die mit diesem Allel assoziiert sind, im Vergleich zu Patientinnen und Patienten mit anderen Allelen schwerere Phänotypen zeigen. Offensichtlich sind weitere Untersuchungen erforderlich, um zu erklären, wie diese Mutation ausgeprägtere Symptome verursachen kann. Alle bislang berichteten Patientinnen und Patienten sind kaukasischer Herkunft, was bedeutet, dass die Häufigkeit dieser genetischen Erkrankung zwischen ethnischen Gruppen variieren kann.