Prolidase

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Einführung

Prolidase ist eine metalloabhängige Hydrolase, die für die Hydrolyse von Xaa-Pro und Xaa-Hyp Dipeptiden verantwortlich ist. Ihre Struktur ähnelt sehr der Methionin-Aminopeptidase, Aminopeptidase P und Kreatinase und gehört zusammen mit diesen Enzymen zur sogenannten "Pita-Brot"-Familie. Neben der strukturellen Ähnlichkeit wird der katalytische Mechanismus auch von Mitgliedern dieser Enzymfamilie geteilt. Prolidasen existieren in allen Lebensreichen. Einige Menschen glauben, dass Prolinase an der Beschaffung von Nährstoffen und an der Antitoxinabwehr in Prokaryoten beteiligt ist, aber die tatsächliche physiologische Rolle der Prolinase in einzelligen Organismen muss noch untersucht werden. Die hydrolytische Aktivität der bakteriellen Prolinase wurde in der Biotechnologieindustrie genutzt, um die Bitterkeit von Käse zu reduzieren und als Dekontaminationsmittel.

Zwei zweiwertige Kationen, die durch die Hydroxylgruppe im aktiven Zentrum verbunden sind, sind wesentliche Bestandteile dieses Enzyms. Prolinase aus anderen Organismen kann eine Vielzahl von Metallkationen wie Fe²⁺, Zn²⁺ oder Co²⁺ aufnehmen, während die menschliche Prolinase strenge Anforderungen an Mangan zeigt. Aufgrund des relativ engen Substratspektrums glauben Wissenschaftler, dass Prolinase und andere Pita-Brot-Aminopeptidasen die Zellfunktion regulieren können, zusätzlich zur Teilnahme an der Verdauung. Bei Homo sapiens wird der Kollagenstoffwechsel als das Hauptziel der Prolinase angesehen. Es wurde gezeigt, dass mehrere menschliche Krankheiten mit der Aktivität der Prolinase in Verbindung stehen können. Ihr Verlust, verursacht durch Mutationen im PEPD-Gen, ist die Ursache für die Prolinase-Defizienz (PD), eine seltene genetische Erkrankung, die derzeit nicht heilbar ist. Die Prolidase-Aktivität steht auch im Zusammenhang mit neurodegenerativen und psychiatrischen Störungen, und immer mehr Beweise zeigen, dass sie auch mit der Tumorigenese in Verbindung steht.

Abbildung 1. Piktoriale Ansicht der menschlichen Prolidase-Struktur (Wilk, P.; et al. 2020)

Häufigkeit und Genetik

Pita-Brot-Metalloproteinasen existieren in allen Lebensreichen, von Bakterien und Archaeen über einfache Eukaryoten bis hin zu komplexen mehrzelligen Organismen. Bisher ist die genaue Funktion der Prolinase in einzelnen einzelligen Organismen noch unklar. Bei Escherichia coli zeigten die prolinase-defizienten Stämme keine signifikanten phänotypischen Unterschiede, obwohl angenommen wird, dass die Mutantenstämme eine verringerte Fähigkeit zeigen werden, Oligopeptide als Nahrungsquelle zu nutzen. Bei Bacillus subtilis spielt die Prolinase eine wichtige Rolle bei der Osmoregulation, indem sie freies Prolin freisetzt. Bei Mycobacterium tuberculosis spielen Prolinase-Varianten eine Rolle bei der Antibiotikaresistenz. Aufgrund ihrer Eigenschaften zur Hydrolyse von organophosphorhaltigen Verbindungen könnte die Protease auch einen allgemeinen Antitoxinschutz bieten. Es wird angenommen, dass diese Prolinase in höheren Eukaryoten höchstwahrscheinlich an der Remodellierung der extrazellulären Matrix beteiligt ist. Das menschliche Prolinase-Gen (PEPD) befindet sich auf Chromosom 19 und enthält 15 Exons mit einem Molekulargewicht von 54 kDa. Viele Mutationen im PEPD-Gen stehen in engem Zusammenhang mit der Prolinase-Defizienz. Der höchste Grad an Erhaltung kann in und um das aktive Zentrum des Enzyms beobachtet werden, und es wird vorhergesagt, dass die schädlichsten Mutationen im PEPD-Gen mit den am stärksten konservierten Regionen in Verbindung stehen.

Abbildung 2. Superposition der jeweiligen Kristallstrukturen, die die entscheidenden Seitenketten als Stäbchen hervorheben (Wilk, P.; et al. 2020)

Biotechnologie

Organophosphorverbindungen (OP) sind die Hauptbestandteile vieler chemischer Kampfstoffe und Pestizide. Das Chemiewaffenübereinkommen verbot die Verwendung von Gasen zu militärischen Zwecken und verpflichtete die Länder zur Zerstörung von Waffenlagern. Aufgrund ihrer extrem hohen Stabilität wird die Zerstörung von OPs jedoch schwierig und kostspielig. Daher streben die Menschen an, umweltfreundlichere Reinigungsmethoden zu entwickeln. Eine besonders effektive Enzymklasse wurde gefunden, die Organophosphor-Anhydrase (OPAA), und die am meisten untersuchte OPAA stammt von Alteromonas sp.

OPAAs teilen eine hohe Sequenzidentität (~50%) mit der Prolinase von E. coli und sind ebenfalls in der Lage, Xaa-Pro-Dipeptide zu hydrolysieren. Ähnlich zeigt die Prolinase auch OPAA-Aktivität. Für die menschliche Prolinase haben verschiedene Methoden wie Enzymimmobilisierung und -engineering die Affinität des Enzyms um das 1.000.000-fache erhöht und die Hydrolysegeschwindigkeit von Paraoxon um das 30-fache gesteigert. Der zweite Anwendungsbereich der Prolinase-Aktivität ist die Lebensmittelindustrie, insbesondere der Milchbereich. Mikrobielle Fermentation führt zum Abbau von Kasein und führt zu bitter schmeckenden, hauptsächlich hydrophoben Peptiden. Mehrere Peptidasen, die spezifisch für prolinhaltige Peptide sind, wurden in der Lebensmittelproduktion weit verbreitet eingesetzt. Übermäßige Prolin-Enzyme, die zusammen mit anderen Peptidasen verwendet werden, beschleunigen die Käse-Reifung und reduzieren die allgemeine Bitterkeit.